副豬嗜血桿菌多基因位點分子分型研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)是豬格拉瑟氏病的病原菌,引起豬多發(fā)性漿膜炎的敗血癥或以多發(fā)性漿膜炎,心包炎,關節(jié)炎以及腦膜炎。用傳統(tǒng)免疫學方法已證明副豬嗜血桿菌有15個血清型且各血清型之間無交叉保護作用。然而,用傳統(tǒng)的血清型分型方法每年有高達15-20％的野生株不能分型。為了克服這些不足,發(fā)展了基于DNA指紋圖譜的基因分型(限制性內(nèi)切酶圖譜,腸桿菌基因間保守重復序列ERIC-PCR)等研究,然而,這些分型

2、技術都是基于不同條帶大小的比對,產(chǎn)生的數(shù)據(jù)很難共享,無法全面性比較,菌群之間的相互關系信息也很少,同時現(xiàn)階段我國目前尚無用于血清型和血清學研究的特異性血清和抗原。因此,用DNA測序的方法研究多基因位點分型,對于了解副豬嗜血桿菌的群體結(jié)構(gòu)和遺傳關系,揭示菌株的基因型與毒力之間的相關性,為革拉瑟氏病免疫預防奠定基礎有著重要的意義。
　　 我們采用分子生物學方法分別對副豬嗜血桿菌86個分離株的7個持家基因,包括ATP合成酶β鏈(atp

3、D)、翻譯起始因子IF-2(infB)、核糖體蛋白β亞基(rpoB)、蘋果酸脫氫酶(mdh)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6pgd)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(g3pd)和延胡索酸還原酶B(frdB)進行了PCR擴增；對擴增產(chǎn)物進行了測序；分析了序列類型(ST)；構(gòu)建了鄰聯(lián)(NJ)樹和系統(tǒng)進化(UPGMA)樹,分析了菌株之間的進化關系。主要結(jié)果如下:
　　 1.7對引物用于副豬嗜血桿菌7個持家基因的擴增；在同一優(yōu)化的PCR反應條件下,每個

4、菌株都擴增出7個大小為450～600bp的條帶。
　　 2.對46個菌株的7個基因位點的序列進行測序,用軟件對序列編輯、隊列比對、建立MLST定義、等位基因序列文件等,并和PUBMET公布的40株菌株7個基因位點的序列一起,與牛津大學動物系Keith Jolley合作建立了副豬嗜血桿菌86個分離株的MLST數(shù)據(jù)庫,建立在國際互連網(wǎng)上的這些分離株的等位基因圖譜或序列型,構(gòu)成了可以不斷擴展的真實分離株資料。這些資料為進一步構(gòu)建副豬嗜

5、血桿菌分離株流行病學的全球完整圖譜和更詳細的研究該微生物的群體遺傳學提供了重要基礎。
　　 3.經(jīng)START2分析發(fā)現(xiàn)所研究的分離株有高度的遺傳異源性,86個菌株被分成74個序列類型。基因平均距離為0.674,IA=0.804。每個基因位點存在64～76不等數(shù)目的等位基因。基因序列多態(tài)性位點最大(fedB)達325和(6pgd)219,最小(infB)為77。
　　 4.用UPGMA分析確定了5個菌群。
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