紫花苜蓿鹽誘導(dǎo)基因MsPBL和MsALD的克隆分析.pdf

1、土壤鹽漬化對(duì)農(nóng)作物的影響已成為一個(gè)全球性問題，目前全球6％的陸地面積受到不同程度的鹽漬化，2％的非灌溉型耕地和近2O％的灌溉型耕地都發(fā)生了不同程度的鹽漬化，其中很大部是由于土壤中的鹽分經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的積累而自然形成的。除了造成土壤鹽漬化的自然因素外，近年來還有相當(dāng)一部分是由于對(duì)耕地的不合理開墾和灌溉造成的。為了開發(fā)利用這些鹽漬化耕地，目前一個(gè)比較好的途徑是選育出具有較強(qiáng)耐鹽性的作物新品種。
　　 不同植物對(duì)鹽的耐受能力存在較大差異性

2、，以植物根部在鹽脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)為例，其生長(zhǎng)受抑制過程分為兩個(gè)階段：首先是對(duì)鹽形成的滲透壓產(chǎn)生一個(gè)迅速的反應(yīng)，然后在葉片中不斷積累鹽離子，當(dāng)鹽離子積累到一定程度的時(shí)候就會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性作用。在首先形成的滲透壓抑制生長(zhǎng)過程中，當(dāng)鹽形成的滲透壓達(dá)到一個(gè)閾值時(shí)其對(duì)根部的生長(zhǎng)抑制作用非常明顯；然后因?yàn)殡x子積累而形成毒性作用的過程中老葉中的離子先積累到一定程度從而導(dǎo)致其死亡。植物的耐鹽作用主要分為三個(gè)方面：滲透壓耐受作用、葉片的排Na+作用、組織

3、耐受作用。
　　 土壤中過量的鹽分影響植物生理和代謝的各個(gè)方面。植物在鹽脅迫下將產(chǎn)生的大量應(yīng)激反應(yīng)，盡管部分應(yīng)激反應(yīng)是為了適應(yīng)高鹽環(huán)境，但其中的大部分僅僅是鹽脅迫帶來的傷害作用的病理學(xué)表現(xiàn)。弄清楚這些應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)理十分重要，因?yàn)樗鼈優(yōu)樘岣咧参锬望}性提供了很好的研究方向。通常可以將這些適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)分為三類：保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；鹽脅迫損傷的控制、修復(fù)或解毒作用；生長(zhǎng)調(diào)控。相應(yīng)的鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)可以分為三種：細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)重建信號(hào)、對(duì)逆境損

4、傷進(jìn)行修復(fù)的解毒信號(hào)、在特定逆境環(huán)境下調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和膨脹的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　 通過研究與鹽相關(guān)的植物突變體進(jìn)而獲得控制相應(yīng)性狀的基因，以及研究在鹽脅迫下相關(guān)基因的差異表達(dá)是目前研究植物耐鹽機(jī)理比較常見的方法。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上一種重要的飼料作物，總體而言紫花苜蓿是一種耐鹽性較強(qiáng)的植物，但不同紫花苜蓿品種之間的耐鹽性差異較大。目前國(guó)內(nèi)外已選育出幾個(gè)紫花苜蓿耐鹽品種。其中中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所選

5、育的耐鹽新品種“中苜一號(hào)”是一個(gè)在耐鹽性和產(chǎn)量方面都具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的紫花苜蓿品種。
　　 因此以“中苜一號(hào)”為材料，研究其耐鹽堿機(jī)理對(duì)于紫花苜蓿乃至其它植物的耐鹽機(jī)理的認(rèn)識(shí)有著重要意義，同時(shí)對(duì)選育出更好的耐鹽堿苜蓿品種具有重要意義。為了研究紫花苜蓿在鹽脅迫下參與抗鹽過程的分子機(jī)理，我們先前構(gòu)建了一個(gè)“中苜一號(hào)”紫花苜蓿鹽脅迫抑制消減雜交（SSH）cDNA文庫(kù)，得到了大量與鹽脅迫相關(guān)基因的EST序列。本研究的主要內(nèi)容就是在此文庫(kù)中未

6、知基因EST序列的基礎(chǔ)上通過末端快速克隆法（RACE）克隆出鹽脅迫相關(guān)基因的全長(zhǎng)序列，并最終分離克隆出兩個(gè)新基因。其中一個(gè)基因經(jīng)比對(duì)后在其它幾個(gè)物種中找到了同源基因，但這些基因的功能還未知，此基因中包含一個(gè)PB1結(jié)構(gòu)域，推測(cè)此基因可能與鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)；另一個(gè)基因的核酸序列和推測(cè)氨基酸序列與豌豆（Pisum sativum）和紅三葉草（Trifolium pratense）的果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因相似性在90％以上。先后對(duì)這兩

7、個(gè)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位分析、表達(dá)量分析、轉(zhuǎn)基因研究分析。
　　 克隆出的一個(gè)含有PB1結(jié)構(gòu)域的基因通過亞細(xì)胞定位分析表明其定位于細(xì)胞核的可能性較大，我們還成功克隆出此基因轉(zhuǎn)錄上游約1500 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，實(shí)時(shí)定量分析表明分別在300 mM NaCl、100uM ABA和20％PEG6000處理后此基因的表達(dá)量明顯升高，初步判斷其為鹽誘導(dǎo)下參與信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)基因，但其具體功能還不確定，有待進(jìn)一步研究。將此基因編

8、碼區(qū)插入到PBI121載體轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性煙草葉片與野生型煙草葉片在鹽脅迫下表現(xiàn)出一定差異性。克隆出的另外一個(gè)基因初步確認(rèn)為紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（MsALD）基因。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明MsALD基因定位于葉綠體的可能性最大。半定量RT-PCR分析表明，MsALD基因在300 mM NaCl脅迫2小時(shí)后表達(dá)量上升，即MsALD基因受鹽誘導(dǎo)。因此推測(cè)MsALD基因可能參與紫花苜蓿體內(nèi)抗鹽過程，但其參與抗鹽過程的具體作用機(jī)