多西環(huán)素間接競爭ELISA檢測方法的建立.pdf

1、多西環(huán)素(Doxycycline，DOX)是一種常用獸用抗生素，是動物源性食品中最常見的獸藥殘留之一，當(dāng)不遵守休藥期或不按規(guī)范添加用藥時，DOX就會殘留在動物組織及其副產(chǎn)品中（包括蛋、奶）。殘存于動物產(chǎn)品中的DOX及其代謝產(chǎn)物會嚴重威脅人類健康。
　　 在國內(nèi)及國外已經(jīng)建立起了多種檢測DOX藥物殘留的儀器檢測方法，雖然其中有些方法在靈敏度、精確度上都比較令人滿意，但由于操作步驟繁瑣（復(fù)雜的樣品處理過程等）、消耗時間多、費用較高、

2、對操作人員技術(shù)要求全面等原因而不適合基層及大批量樣品的檢測。免疫學(xué)檢測方法以其較高的敏感性、特異性，和簡便性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域。本研究旨在建立動物性產(chǎn)品中DOX殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫(ic-ELISA)檢測方法，為進一步試劑盒的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　 1.多西環(huán)素抗體的制備與鑒定。
　　 通過人工合成抗原，免疫3-4月齡雄性新西蘭大白兔，產(chǎn)生了針對DOX的特異性抗體，經(jīng)間接ELISA

3、檢測多克隆抗體效價最高達1:80,000。并采用辛酸-硫酸銨法及G200過濾純化。
　　 2.多西環(huán)素間接競爭ELISA條件的優(yōu)化。
　　 采用間接及間接競爭ELISA方法確定了抗原、抗體工作濃度分別為0.5μg/mL和1:32,000的抗體稀釋倍數(shù)，最佳包被條件為4℃下過夜，最佳抗原抗體競爭反應(yīng)時間為15min。
　　 3.多西環(huán)素間接競爭ELISA檢測方法的建立。
　　 采用ic-ELISA方法，建立

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到DOX的半數(shù)抑制(IC50)值為8.74μg/L,檢測限為1.96μg/L。該方法檢測范圍為1.96-160μg/L。批內(nèi)平均變異系數(shù)在肝臟和肌肉樣品中分別為5.75％和7.53％；批間平均變異系數(shù)在肝臟和肌肉樣品中分別為5.92％和7.21％。交叉反應(yīng)試驗表明除土霉素有10.71％的交叉反應(yīng)外，其他類似結(jié)構(gòu)交叉反應(yīng)均較弱。這些結(jié)果表明采用ic-ELISA檢測多西環(huán)素的方法是可行的。
　　 4.樣品添加回收試驗。<