棉花GhAQP2和GhCYP1基因的克隆、表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、棉花是一種全球性的經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維作為重要的天然纖維，是紡織工業(yè)的重要原材料。隨著紡織業(yè)的發(fā)展，新的紡織技術(shù)對(duì)棉花的品質(zhì)要求越來越高，培育纖維長(zhǎng)、強(qiáng)、細(xì)兼?zhèn)涞拿藁ㄆ贩N是全世界棉花育種的主攻內(nèi)容之一。利用基因工程技術(shù)對(duì)棉花發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行分離鑒定、表達(dá)調(diào)控分析，系統(tǒng)地解析棉花生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理，對(duì)于提高棉花產(chǎn)量和改良品質(zhì)具有重要的生物學(xué)理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 水通道蛋白（aquaporin，AQP）是定位于生物膜上的一

2、類古老的通道蛋白，能夠高效運(yùn)輸水分，在整個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答中起重要作用。親環(huán)素蛋白（cyclophilin，CYP）作為一類具有肽酰脯胺順反異構(gòu)酶（PPIase）活性的多功能蛋白家族，在植物生物學(xué)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。我們從棉花中分離出1個(gè)編碼AQP的基因和1個(gè)編碼CYP的基因，本文主要對(duì)這兩個(gè)基因在棉花不同組織，不同發(fā)育天數(shù)的纖維中的表達(dá)情況以及功能進(jìn)行初步分析，該研究有望為利用基因工程改良棉花的品質(zhì)提供重

3、要地功能基因，研究結(jié)果如下：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)室前期通過SSH技術(shù)從棉花cDNA文庫中分離篩選出兩個(gè)cDNA片段，獲得全長(zhǎng)后分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因一個(gè)編碼水通道蛋白，一個(gè)編碼親環(huán)素蛋白，分別被命名為GhAQP2和GhCYP1。GhAQP2全長(zhǎng)1310bp，含3個(gè)內(nèi)含子，編碼279個(gè)氨基酸，同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其屬于PIP2類。GhCYP1全長(zhǎng)801bp，編碼174個(gè)氨基酸。
　　 2.通過半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技

4、術(shù)對(duì)兩個(gè)基因在棉花不同器官和不同發(fā)育天數(shù)纖維的表達(dá)進(jìn)行分析，從表達(dá)特征來看，GhAQP2在根中有一定量的表達(dá)，在莖、葉、花中少量表達(dá)，在胚珠和纖維細(xì)胞中表達(dá)受發(fā)育調(diào)控，在開花后6-18天的纖維中持續(xù)高效表達(dá)，開花后21天開始表達(dá)量逐漸下降，表明其可能參與了纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育。GhCYP1在根、莖、葉、花、胚珠和纖維細(xì)胞中都表達(dá)，在葉以及開花后第15天的纖維中表達(dá)量最高。對(duì)GhCYP1基因在棉花干旱脅迫不同時(shí)間長(zhǎng)度的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在脅

5、迫2小時(shí)后表達(dá)量達(dá)到最高，6小時(shí)后表達(dá)量降低。
　　 3.為初步探究GhAQP2基因的功能，構(gòu)建了GhAQP2過表達(dá)載體。通過共培養(yǎng)對(duì)煙草懸浮細(xì)胞BY-2進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因的BY-2細(xì)胞與同步培養(yǎng)的野生型比較，其生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)，長(zhǎng)度有所增長(zhǎng)。以pUCm-T作為中間載體以及 PZP35S 作為最終表達(dá)載體構(gòu)建了GhAQP2基因的干擾表達(dá)載體，為研究其在棉花中的功能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)用pREP5N構(gòu)建GhCYP1酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化SPQ0