香雪蘭UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶基因的克隆及其功能鑒定.pdf

1、香雪蘭(Fressia hybrida)，鳶尾科香雪蘭屬多年生球根草本花卉，原產(chǎn)非洲南部好望角，現(xiàn)廣為栽培，是世界十大名貴切花之一，主要用于盆栽和切花生產(chǎn)。目前，香雪蘭約有500種園藝品種，在生產(chǎn)上常根據(jù)花色分為紅色系、黃色系、白色系、藍色系等栽培品系，由于香雪蘭花色艷麗且豐富，是進行植物花色研究的理想材料。
　　在植物花色形成過程中，UDP-葡萄糖:類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶(UF3GT)通常作用于花色苷合成途徑的最后一步，其

2、能夠催化UDP-葡萄糖中的糖分子轉移到花色素的3’羥基位點上，將花色素轉化生成穩(wěn)定的花色苷，該催化步驟對花色素的穩(wěn)定性及其在液泡中的溶解性至關重要。
　　本論文以香雪蘭UF3GT作為研究對象，進行基因克隆，并對該基因的功能進行研究，初步探討了UF3GT與花色形成之間的關系，為利用基因工程方法改良植物花色奠定基礎。主要研究方法與結果如下:
　　1.通過cDNA文庫篩選和3'RACE的方法克隆得到香雪蘭UF3GT基因的全長cDN

3、A序列。序列分析表明，該cDNA序列長為1614bp，其中開放閱讀框架長1338bp，編碼的蛋白序列長為445個氨基酸，推測蛋白質的分子量是48，043Da，等電點為6.02，命名為Fh3GT1(Genbank登錄號:HM590645)。通過Fh3GT1氨基酸的同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明:該基因是UF3GT基因家族中的一個新成員。
　　2.利用半定量RT-PCR方法分析在紅花香雪蘭的不同開花階段、不同器官以及不同花色品種中Fh3G

4、T1基因的表達情況。Fh3GT1基因在紅花香雪蘭的花、莖、葉中均有表達，當香雪蘭花瓣處于完全開放階段時，F(xiàn)h3GT1基因的表達量達到最高;在不同花色香雪蘭品種中，該基因在紅花和粉花香雪蘭的花瓣中表達最高，黃花香雪蘭次之，而在白花香雪蘭中表達量最低。
　　3.構建Fh3GT1基因的重組原核表達載體(pET-Fh3GT1)，并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導蛋白的體外表達并進行酶活檢測。SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白分子量

5、約為48 kDa，與預測的該基因編碼蛋白的分子量相同。體外酶活檢測反應顯示反應產(chǎn)物中有花色苷的生成，說明原核表達制備的Fh3GT1蛋白具有糖基轉移酶的活性，初步證明克隆得到的基因是UDP-葡萄糖:類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶基因。
　　4.構建Fh3GT1::GFP融合表達載體，通過農桿菌侵染法在洋蔥(Allium cepa)表皮細胞中瞬時表達Fh3GT1::GFP融合蛋白。對Fh3GT1進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要分布在細胞質

6、中，屬于胞質蛋白。
　　5.構建pBI-Fh3GT1雙元表達載體，通過農桿菌侵染法轉化矮牽牛，過量表達Fh3GT1基因，驗證其生物學功能。結果統(tǒng)計，共得到轉基因矮牽牛植株7株，通過PCR和Southern雜交鑒定，表明外源基因基因成功整合到轉基因矮牽牛植株的基因組中。得到含有單拷貝Fh3GT1基因的轉基因紅花矮牽牛5株，其總花色苷含量平均下降40％，花瓣邊緣出現(xiàn)白斑和顏色缺失;得到含有二個拷貝Fh3GT1基因的轉基因矮牽牛2株，總

7、花色苷含量平均下降80％，花色從紅色變成深粉色。
　　6.構建pART-Fh3GT1i干擾表達載體，選擇Fh3GT1基因序列中3’端保守區(qū)的一段長為347 bp的片段作為靶基因，構建含有內含子的發(fā)卡RNA(hpRNA)結構，利用RNAi原理干擾矮牽牛內源UF3GT基因的表達，為研究Fh3GT1基因的功能奠定基礎。結果統(tǒng)計，共得到轉基因矮牽牛植株5株，通過PCR和Southern雜交鑒定，表明外源基因基因成功整合到轉基因矮牽牛植株的