花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆和功能初步研究.pdf

1、花生是重要的油料作物之一，其種子含有豐富的脂肪酸。脂肪酸代謝調(diào)控過(guò)程中關(guān)鍵酶基因的分離和克隆使得利用遺傳基因工程手段改良脂肪品質(zhì)成為可能，采用基因工程手段有望獲得穩(wěn)定高產(chǎn)、目的脂肪酸含量豐富、滿足各種需求的植物脂肪酸，具有巨大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　 溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)是控制代謝過(guò)程中溶血磷脂酸形成不同的磷脂酸的流向的關(guān)鍵酶。本文根據(jù)植物溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶保守的氨基酸序列，通過(guò)比對(duì)同源性較高的區(qū)域，設(shè)計(jì)改良

2、的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR，從花生cDNA文庫(kù)中釣取出一個(gè)LPAAT基因cDNA片段，再根據(jù)獲得的部分序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲得該cDNA的3'和5'序列，從而得到全長(zhǎng)為1561個(gè)堿基的cDNA序列，分析表明該序列具有一個(gè)長(zhǎng)度為1131bp，編碼376個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框(ORF)，生物信息學(xué)分析表明該氨基酸序列具有保守的?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，將該基因的的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與蓖麻L(zhǎng)PAAT(Ri

3、cinus communis putative lysophosphatidic acid acyltransferaseLPAAT GenBank：ACB30546.1)的氨基酸同源性為90％，和油桐(Vernicia fordiiputative glycerol-3-phosphate acyltransferase GenBank：ACT32030.1)同源相似性為90％，故將其任命為AhLPAA T(Arachis hypog

4、aea Lysophosphatidic AcidAcyltransferase)。并且我們還克隆了該基因的DNA序列(全長(zhǎng)為3822bp)，到目前為止，這是花生中第一次成功進(jìn)行溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆。
　　 將AhLPAAT的氨基酸序列與各物種進(jìn)行同源分析，并運(yùn)用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。序列分析表明該基因的蛋白編碼區(qū)含有三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域。我們?cè)诖竽c桿菌pGEX4T-1原核表達(dá)體系中進(jìn)行誘導(dǎo)表

5、達(dá)獲得AhLPAAT基因及其截?cái)嗷虻牡鞍妆磉_(dá)產(chǎn)物，純化蛋白并成功制備了抗體。利用RT-PCR結(jié)合qRT-PCR深入研究分析該AhLPAAT在花生各組織中的表達(dá)模式。利用洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系研究AhLPAAT基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，初步表明該蛋白定位在質(zhì)膜上。
　　 運(yùn)用溫度敏感LPAAT缺陷型大腸桿菌JC201進(jìn)行溫度互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，陰性結(jié)果表明該AhLPAAT不能互補(bǔ)大腸桿菌JC201的功能缺失，初步判斷AhLPAAT不是一類質(zhì)體L