紅豆杉細胞遺傳轉化體系優(yōu)化及轉基因細胞株ORCA3、MET1-RNAi基因表達分析.pdf

1、紅豆杉細胞大規(guī)模培養(yǎng)是最有前景的解決紫杉醇藥源途徑之一。紅豆杉細胞培養(yǎng)過程中紫杉醇含量低而且極不穩(wěn)定在一定程度上限制其工業(yè)化生產(chǎn)。隨著紫杉醇生物合成途徑的闡明和關鍵酶及轉錄因子的克隆，使得通過利用基因工程方法構建高產(chǎn)轉基因細胞株成為可能。目前紅豆杉細胞遺傳轉化體系的研究相對較少，本文對根癌農(nóng)桿菌介導的紅豆杉細胞遺傳轉化進行了系統(tǒng)研究，并獲得了系列轉基因的細胞株。主要結果如下：
　　 1）植物表達載體構建。首先從長春花和擬南芥中分

2、別克隆到ORCA3和DNA甲級轉移酶MET1基因，然后分別構建了ORCA3 植物表達載體和MET1-RNAi 干涉載體，并轉化到土壤農(nóng)桿菌EHA105菌株中。
　　 2）對根癌農(nóng)桿菌介導的紅豆杉細胞遺傳轉化體系進行優(yōu)化。
　　 對影響紅豆杉細胞遺傳轉化的主要因素,如菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)溫度和時間等進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的轉化條件是：選用農(nóng)桿菌菌株EHA105、以生長狀態(tài)良好的曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞為受體材料、菌液光

3、密度OD600=0.6、侵染時間25min、共培養(yǎng)最適溫度21℃、共培養(yǎng)時間為48 h；最適的頭孢霉素抑菌濃度、潮霉素篩選濃度分別為300 mg/L和8 mg/L。最優(yōu)的除菌及篩選方式為：用含100mg/L 頭孢霉素的無菌水沖洗10 s 共培養(yǎng)結束的細胞材料，然后將材料轉至含300mg/L 頭孢霉素的抑菌培養(yǎng)基上，兩周后轉至含150 mg/L 卡那霉素或8 mg/L 潮霉素的篩選培養(yǎng)基上,篩選3個周期可獲得轉基因細胞株。
　　

4、3）轉基因細胞株ORCA3基因表達分析。對篩選出的陽性細胞進行GUS組織化學活性染色、外源基因的PCR擴增檢測和western blot分析，結果表明，外源目的基因已經(jīng)成功整合到紅豆杉基因組中，并在蛋白質水平得到表達；用HPLC 法檢測紫杉醇含量，發(fā)現(xiàn)轉基因細胞株紫杉醇含量變化趨勢并不相同，這可能是由插入位點的不同導致的。轉基因細胞株紫杉醇的最高含量為159.3 μg/g 干重，為對照組的2.5倍。
　　 4）轉基因細胞株MET