毛白楊二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因在煙草中的功能驗證.pdf

1、起源于苯丙氨酸次生代謝途徑的黃酮類化合物是植物重要的次生代謝產物。參與植物的花色形成、紫外線防護、抵抗病原體，花粉發(fā)育，激素的運輸。在植物與微生物間的互利共生作用中扮演重要作用。大量研究表明黃酮類化合物在人體中具有多種生物活性，包括抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗發(fā)炎、血管舒張活性等。
　　 雖然通過共同的前體物質闡述了植物的黃酮類化合物合成途徑，但是長時間以來，研究重點主要集中于一年生草本植物擬南芥基因組中的分子信息?，F(xiàn)在隨著楊

2、樹基因組序列的獲得，了解和開發(fā)樹種的次生代謝將會實現(xiàn)。
　　 目前研究已知，楊樹的苯丙氨酸生物代謝途徑中存在基因的結構和功能更為復雜。在楊樹和其他快速生長樹種中，黃酮化合物和水楊酸酚存在許多不同形式的功能，在葉片中的含量占到總生物量的50％。從分子水平破解楊樹的次生代謝密碼，對了解次生代謝產物對樹木自身生長及其對生態(tài)系統(tǒng)多樣性的潛在影響，具有重要意義。
　　 二氫黃酮醇4-還原酶(DFR；EC1.1.1.219)是黃酮類

3、化合物合成途徑靠后階段的關鍵酶。它催化二氫堪非醇(dihydrokaempferol，DHK)，二氫櫟皮黃酮(dihydroquercetin，DHQ)和二氫楊梅黃酮(dihydromyricetin，DHM)三種黃烷酮醇轉化為的無色花色素，可作為花青素和縮合單寧(原花色素)的前體物質。
　　 從毛白楊中分離到兩個DFR基因的cDNA片段(PtDFR1和PtDFR2)。構建CaMV35S啟動子調控的正義表達載體pBK-DFR1-

4、S和pORE4-DFR2-S，反義表達載體pBK-DFR-As，轉入農桿菌LBA4404。葉盤法轉化煙草后，卡那霉素50mg/L做為選擇壓，篩選出轉化植株。
　　 以野生型煙草植株為陰性對照，以攜帶外源目的基因的質粒為陽性對照，以提取轉化植物基因組DNA為模板，PCR擴增外源基因NPTII和DFR以鑒定轉化植株，結果表明外源基因已成功插入轉化植株基因組中。
　　 RT-PCR檢測外源基因(PtDFR)在轉錄水平表達情況。

5、提取轉化和未轉化植物總RNA，反轉錄合成cDNA，以18s rRNA基因為內參，調整cDNA模板濃度一致，擴增外源基因。結果發(fā)現(xiàn)與對照組(未轉化植株)相比，正義轉化植株在轉錄水平存在外源基因DFR表達，反義轉化植物外源基因轉錄水平表達比正義相比受到明顯抑制。
　　 煙草轉化植物的花色表現(xiàn)型出現(xiàn)差異，野生型煙草的花瓣顏色為粉紅色。轉DFR1基因正義表達載體的轉基因植株，花瓣顏色明顯偏紅，有的甚至雌蕊的顏色也出現(xiàn)紅色。在轉DFR反義

6、表達載體的轉基因植株中，花瓣顏色趨于白色，僅在邊緣存在可見的淡粉紅色。在轉DFR2正義表達載體的轉基因植株，花瓣顏色與野生型趨于相同，不存在明顯差異。
　　 提取了轉化煙草植株中花瓣的花青素進行HPLC分析，檢測矢車菊素3-阿拉伯糖苷單體。與野生型煙草相比，攜帶有外源基因DFR1正義載體的轉化植株，峰面積明顯增大；反義載體的轉化植株，峰面積明顯減小。攜帶有外源基因DFR2正義載體的轉化植株，峰面積差異不顯著。
　　 以蘆