茶樹(shù)谷氨酰胺合成酶和茶氨酸合成酶基因原核表達(dá)、抗體制備及其表達(dá)差異的研究.pdf

1、茶氨酸是茶樹(shù)體內(nèi)特有的氨基酸，不僅是茶的主要呈味物質(zhì)，也是其主要功能成分，可以改善人體免疫功能，提高抵抗力等。茶氨酸合成酶(TS)和谷氨酰胺合成酶(GS)是茶氨酸代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶。谷氨酰胺合成酶廣泛存在于原核與真核生物體內(nèi)，是參與高等植物體內(nèi)氨同化過(guò)程的關(guān)鍵酶；茶樹(shù)根部以GS/GOGAT為主要途徑，利用無(wú)機(jī)氮合成谷氨酸及其酰胺。提高谷氨酰胺合成酶的活性，有利于茶樹(shù)體內(nèi)茶氨酸的合成。茶氨酸合成酶直接參與了茶樹(shù)體內(nèi)的茶氨酸合成，前人雖

2、已從茶鮮葉中分離出茶氨酸合成酶，并進(jìn)行了初步的酶學(xué)特性研究，由于其極不穩(wěn)定，難以進(jìn)一步分離純化，相關(guān)研究一直停滯不前。
　　 本文對(duì)茶樹(shù)的TS和GS基因進(jìn)行了體外表達(dá)，純化獲得目的蛋白后通過(guò)免疫家兔制備獲得抗體，利用免疫印跡雜交技術(shù)從蛋白水平上檢測(cè)鹽脅迫和遮蔭處理?xiàng)l件下茶苗根和新梢中TS、GS的表達(dá)差異；采用HPLC方法檢測(cè)了樣品中游離氨基酸的含量，探討NaCl處理和遮蔭處理對(duì)茶樹(shù)體內(nèi)TS、GS的表達(dá)以及對(duì)游離氨基酸代謝的影響。

3、論文取得以下主要結(jié)果：
　　 1．茶樹(shù)TS和GS基因?qū)氡磉_(dá)質(zhì)粒pEASYTS、pEASYGS，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Reastta Good中，經(jīng)異丙基βD硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導(dǎo)大量表達(dá)，分析誘導(dǎo)前后SDSPAGE膠，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后包涵體蛋白約在40 kDa處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，經(jīng)NiNTA親和層析柱純化獲得目的蛋白，免疫家兔獲得抗血清，免疫印跡結(jié)果表明重組茶樹(shù)的TS、GS具有良好的免疫原。
　　 2.以鹽處理及

4、遮蔭處理后茶籽苗的莖葉和根部為試驗(yàn)材料制備粗蛋白提取液，經(jīng)過(guò)SDSPAGE后轉(zhuǎn)膜，采用Western blot和ECL顯色，檢測(cè)TS、GS在樣品中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，低濃度NaCl處理和適當(dāng)?shù)恼谑a處理可以提高茶樹(shù)中TS、GS的表達(dá)量；HPLC檢測(cè)樣品中的游離氨基酸尤其是茶氨酸及谷氨酰胺的含量，結(jié)果表明，遮蔭及鹽脅迫處理后，茶樹(shù)體內(nèi)茶氨酸等游離氨基酸的含量明顯增加。說(shuō)明遮蔭及鹽處理有利于茶樹(shù)體內(nèi)茶氨酸等游離氨基酸的積累，能提高茶葉的品質(zhì)