蘇云金芽胞桿菌新型cry9基因克隆、表達及活性分析.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是一種世界上應用廣泛的生防微生物，它具有高度的殺蟲特異性和對人畜無害的優(yōu)點。主要的殺蟲成份是殺蟲晶體蛋白，其由cry和cyt基因編碼。其中cry9類基因的表達產物對鱗翅目多種害蟲具有較高的殺蟲活性，但是由于檢測方法的局限性，發(fā)現(xiàn)的基因種類不多，活性高的基因更少。為了充分發(fā)掘Bt菌株中cry9類基因資源，本研究建立了一種基于PCR產物，利用高分辨熔解曲線（highresol

2、utionmeltingHRM）進行cry9類基因分型的方法。根據(jù)所有已報道的cry9類基因的保守區(qū)設計一對擴增片段為100bp的通用鑒定引物，利用高分辨熔點儀對產物的熔解曲線進行分析，由于擴增產物的堿基組成不同，不同類型的基因產生不同的熔解曲線，從而將樣品進行基因分類。該方法可以高通量地進行基因分型，特別是可以檢測出已知及新型的cry9類基因。
　　 本研究利用PCR方法鑒定菌株SC5-D2和SC5-E8中分別含有cry9Aa

3、和cry9Ea基因，以上述兩個cry9類基因作為標準樣品對該方法進行了驗證。應用建立的HRM平臺對72株蘇云金芽胞桿菌標準菌株進行cry9類基因型的鑒定，PCR陽性的有3株。根據(jù)熔解曲線發(fā)現(xiàn)B.thuringiensissubsp.fukuokaensis（T03C001）含有cry9Aa基因片段，B.thuringiensissubsp.sumiyoshiensis（T038001）含有cry9Da和兩個新型cry9類基因片段，B.t

4、huringiensissubsp.japonensis（T23001）含有cry9Da基因片段。以上述cry9基因片段為標準樣品應用HRM平臺對2000株分離株進行cry9類基因型的鑒定，PCR陽性的有273株，熔解曲線類型為20類，經測序分析其中菌株SC5.D4菌株中含有cry9Ba基因。
　　 根據(jù)這些基因的全長序列設計擴增cry9類基因的全長引物，成功克隆上述基因，并被國際Bt命名委員會正式命名為cry9Aa3，cry9

5、Ea8，cry9Aa4，cry9Da3，cry9Da4，cry9Eb2。cry9Ee1，cry9Ba3。利用表達載體pEB在大腸桿菌Rosetta（DE3）對這些基因進行表達，表達產物均為130kDa左右的蛋白（Cry9Ba3未表達）。Cry9Aa3，Cry9Aa4，Cry9Eb2，Cry9Ee1對鱗翅目害蟲小菜蛾殺蟲活性較高，LC50分別為1.83μg/mL、1.90μg/mL、1.03μg/mL和1.70μg/mL；且上述四個蛋白對

6、CrylAc抗性小菜蛾毒力較高，LC50分別為1.39μg/mL、1.74μg/mL、1.24μg/mL和1.45μg/mL。表明四種Cry9蛋白在小菜蛾的毒力上與Cry1Ac都沒有交互抗性。而Cry9Ea8，Cry9Da3，Cry9Da4對小菜蛾無活性。Cry9Aa3，Cry9Aa4，Cry9Eb2，Cry9Ee1對另一種鱗翅目害蟲亞洲玉米螟殺蟲活性較好，LC50分別為6.93μg/mL、1.06μg/mL、5.93μg/mL和2.2