水稻紋枯病菌菌核形成過程中特異基因的表達與分析.pdf

1、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是一類十分重要的植物病原真菌,寄主范圍廣泛,可引起包括水稻、小麥、玉米等重要作物在內(nèi)的多種作物菌核病的發(fā)生,危害十分嚴重。而關于水稻紋枯病致病病原菌菌核的形成和發(fā)育機理,目前國內(nèi)外研究已經(jīng)有較多報道,但主要集中于營養(yǎng)和環(huán)境因子等對菌核形成的影響,而在菌核形成的分子生物學研究方面,盡管有了一些有益的探索,但至今仍缺乏深入的研究。許多與立枯絲核菌菌核形成的相關基因有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。

2、　　 本項目采用抑制消減雜交方法(Suppression Subtractive Hybridization,以下簡稱SSH)結(jié)合虛擬Northern篩選方法(virtual Northern)構(gòu)建了水稻紋枯病菌菌核形成過程誘導表達產(chǎn)生的差減cDNA文庫,分離并克隆出菌核形成相關基因,從基因轉(zhuǎn)錄表達水平探討菌核形成機理,以期為水稻紋枯病防治提供理論基礎。項目以GD-118菌株菌絲形成期材料mRNA為驅(qū)動子(driver),以菌核形成期

3、mRNA為檢測子(Tester),分別提取材料總RNA,分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)Rsa-I酶切,連接不同接頭后進行連續(xù)兩次消減雜交和兩次PCR反應以獲得差異表達基因片段。將PCR產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞,通過藍白斑篩選獲得重組克隆,構(gòu)建紋枯病原菌菌核特異性表達cDNA文庫。從庫中隨機篩選145個白色菌落經(jīng)PCR鑒定其中有112個克隆有目的基因片段插入,且插入片段大小主要分布在200-500bp之間。挑取

4、陽性克隆進行測序,所得序列利用DNAMAN軟件去除載體及接頭序列,剔除重復序列,獲得部分差異表達ESTs。對所獲得的ESTs繼續(xù)應用Virtual Northem雜交篩選,以菌絲、菌核cDNA序列為探針進行驗證。將經(jīng)過驗證差異表達明顯的序列做進一步同源性比對并分析相關序列的表達結(jié)果,獲得了菌核形成相關的28條特異表達基因片段,其中有16條序列在GeneBank上較高同源性序列,主要涉及脅迫響應、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導、合成代謝等,其中另有1