野生動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的鑒定及隱孢子蟲(chóng)鈣調(diào)蛋白基因的擴(kuò)增.pdf

1、隱孢子蟲(chóng)?。–ryptosporidisis）是由隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium）引起的一種以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)，且呈世界性分布的人畜共患寄生蟲(chóng)病，該病嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)，也是人類艾滋病患者的主要致死因素之一。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心已將其列為B類病原，我國(guó)2003年將該病列為重點(diǎn)防范的兩種重要寄生蟲(chóng)病之一。近年來(lái)，隱孢子蟲(chóng)病研究在病原生物學(xué)、流行病學(xué)、診斷及綜合防治等方面取得許多重要成果。但是由于隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種間形態(tài)差異

2、不明顯，國(guó)內(nèi)外又缺少隱孢子蟲(chóng)統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)，加之近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，隱孢子蟲(chóng)的新基因型報(bào)道不斷出現(xiàn)，從而引起隱孢子蟲(chóng)種類的分類產(chǎn)生較大的爭(zhēng)議，這給預(yù)防和控制該病帶來(lái)了極大困難。目前隱孢子蟲(chóng)的致病機(jī)理尚未完全清楚，同時(shí)也缺乏公認(rèn)有特效的治療該病藥物，因此，篩選有效的藥物來(lái)防治該病是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。
　　 本課題旨在通過(guò)對(duì)安徽省某動(dòng)物園野生動(dòng)物糞樣中隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，初步篩選出隱孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性野生動(dòng)物，從陽(yáng)性野生動(dòng)物

3、糞樣中分離出隱孢子蟲(chóng)卵囊，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)所獲卵囊進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)野生動(dòng)物源隱孢子蟲(chóng)鈣調(diào)蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，以期為人畜共患隱孢子蟲(chóng)病的防治提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究隱孢子蟲(chóng)的代謝機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 首先，采用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法對(duì)安徽省某動(dòng)物園232份野生動(dòng)物糞樣進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)糞樣中隱孢子蟲(chóng)卵囊的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小、卵形指數(shù)等特征，對(duì)駱駝和獼猴源隱孢子蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，初步鑒定出駱駝源隱孢子蟲(chóng)為安氏隱孢子

4、蟲(chóng)(Cryptosporidium andersoni)，獼猴源隱孢子蟲(chóng)為人隱孢子蟲(chóng)(Chominis)。在本次所檢測(cè)的232份野生動(dòng)物糞樣中，采用飽和蔗糖漂浮法檢測(cè)時(shí)，草食類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)感染率為4.88％(2/41)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的感染率為13.64％(6/44)，肉、雜事類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的感染率為9.09％(4/44)，鳥(niǎo)類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)感染率為6.80％(7/103)；采用改良抗酸染色法檢測(cè)時(shí)，草食類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的感染率為7.3

5、2％(3/41)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)感染率為2.27％(1/44)，肉、雜事類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的感染率為0(0/44)，鳥(niǎo)類動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)感染率為0.97％(1/103)。而采用飽和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法的總感染率分別為8.19％(19/232)和2.16％(5/232)，經(jīng)差異顯著性檢驗(yàn)（卡方檢驗(yàn)），兩種檢測(cè)方法差異極顯著(P＜0.01)。用飽和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊，兩種檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)駱駝感染強(qiáng)度最高。
　　

6、 其次，采用分子生物學(xué)方法對(duì)所分離的隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行分子鑒定。首先，采用蔗糖密度梯度離心法對(duì)分離的隱孢子蟲(chóng)卵囊進(jìn)行純化，取純化的卵囊，先用漩渦振蕩器震蕩20min，加2％DTT，再將卵囊置于-70℃冰箱反復(fù)凍融3次，提取其基因組DNA，備用。分別根據(jù)已報(bào)道隱孢子蟲(chóng)18S rRNA序列和HSP70基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物用于PCR擴(kuò)增，對(duì)所擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，所得序列經(jīng)生物信息學(xué)方法，采用DNAStar軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析，構(gòu)建種系進(jìn)化樹(shù)

7、。結(jié)果表明：采用PCR方法分別擴(kuò)增出540bp和448bp大小的目的基因片段，序列分析可知，此次所分離的駱駝源隱孢子蟲(chóng)為安氏隱孢子蟲(chóng)（C.andersoni）。
　　 最后，采用RT-PCR方法擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)鈣調(diào)蛋白基因。首先，提取本次分離的駱駝源安氏隱孢子蟲(chóng)總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后，根據(jù)已報(bào)道的隱孢子蟲(chóng)鈣調(diào)蛋白基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增目的基因。結(jié)果表明，所擴(kuò)增目的基因片段大小為297bp，與預(yù)期結(jié)果相一致。