豬鏈球菌流行病學及其生物被膜形成機理研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種重要的人畜共患致病性病原菌,可以導致宿主出現(xiàn)化膿性腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎和關節(jié)炎等,到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了33個血清型(1-31,33,和1/2)。2005年夏天,以四川資陽為中心,爆發(fā)了大規(guī)模的豬鏈球菌疫情,死亡豬只647頭,共有215人遭受感染,其中38人死亡。這些人豬鏈球菌疫情將豬鏈球菌的公共衛(wèi)生意義提升到一個新高度。本研究系統(tǒng)分析了豬鏈球菌在我國豬鏈球菌病中的重要性、相關毒力因子及基因型與致病力的關系。豬血

2、漿中的主要成分血纖維蛋白原能夠誘導豬鏈球菌形成生物被膜,病原菌形成生物被膜是病原菌致病的一種機制,通過形成生物被膜,細菌變成持續(xù)性感染,抵抗宿主先天性和特異性免疫系統(tǒng)的清除,幫助細菌抵抗抗生素的殺害。本研究發(fā)現(xiàn)生物被膜形成能力的菌株對比相同基因型的菌株的毒力減弱。通過生物芯片對豬鏈球菌生物被膜形成后的轉錄組與未形成生物被膜的轉錄組進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)并驗證了兩個與生物被膜和致病力相關的基因?，F(xiàn)將主要研究結果報告如下:
　　 1.

3、我國豬鏈球菌分子流行病學相關研究
　　 通過系統(tǒng)的流行病學分析調查,2003-2007年間,在全國共分離到407株豬鏈球菌,占分離的豬源鏈球菌總數(shù)的56.6％,已經(jīng)取代馬鏈球菌獸疫亞種成為我國豬鏈球菌病的主要病原。在這些豬鏈球菌中,血清2型占43.2％,3型占14.7％,其次為4,8,5,7,1/2型(3.2％-6.4％)。2型和系統(tǒng)感染顯著相關,3型和肺炎型病例顯著相關。54％的2型菌株屬于基因型sly+mrp+epf+,這種

4、基因型通過小鼠感染試驗證實與高毒力顯著相關。繼續(xù)對2008-2009年間的流行病學調查表明,2型豬鏈球菌無論是在肺炎型病例還是在系統(tǒng)感染病例中的比例始終最高。3型豬鏈球菌的在肺炎型病例中的重要性已經(jīng)下降,21型有上升趨勢,2型豬鏈球菌已經(jīng)成為我國豬鏈球菌病的主要血清型。通過四環(huán)素抗性基因種類分析和MLST分型,我國爆發(fā)的人豬鏈球菌菌株在這些2型鏈球菌中僅少量存在。我國分離菌株大部分處于毒力強的ST1和ST27complex中,且存在一部

5、分超強毒力ST1和ST7型的菌株,且這些菌株在不斷發(fā)生演化。外周血吞噬實驗結果提示豬鏈球菌的抗吞噬能力與ST型密切相關。ST1相關菌株最強,ST7,ST27 complex的菌株其次,其他ST型菌株最弱。最后,為了快速對這些豬鏈球菌進行MLST鑒定進行流行病學分析,建立了核酸質譜分型方法,該方法完成分析僅需要6.5小時,為快速對豬鏈球菌進行分型奠定基礎。
　　 2.豬鏈球菌生物被膜形成菌株的初步應用
　　 從大量的臨床分

6、離株中發(fā)現(xiàn)了一株具有生物被膜形成能力,基因型sly+mrp+epf+的低毒力2型豬鏈球菌菌株。實驗證明該株菌對豬具有很強的免疫原性,用該菌免疫豬后能夠抵抗2型強毒的攻擊,但是對仔豬的安全劑量為5000萬。因此,為了保留其免疫原性,進一步提高此菌株的安全性,繼續(xù)對該菌的芳香族氨基酸合成相關基因aroC基因進行缺失。結果表明:突變株在未補加芳香簇氨基酸的培養(yǎng)基中生長速度顯著下降,但是當培養(yǎng)基中添加三種芳香簇氨基酸后,其生長速度回復。為檢測其

7、安全性和免疫效力,用1億和10億兩個劑量組分別免疫仔豬,二免后第二周檢測抗體同時攻毒。兩個劑量組免疫后安全性良好。第二次免疫后第二周,用2型豬鏈球菌莢膜多糖包被ELISA板測定抗體水平顯著上升。攻毒保護實驗結果表明對照組在第3天全部死亡,1億免疫劑量組2/4保護,保護率50％。10億免疫劑量組3/4保護,保護率75％。取免疫保護組和對照組攻毒后的組織(腦,肺,心肌,脾臟)進行病理切片分析其病理變化,結果表明:對照組對比免疫保護組,存在明

8、顯的腦神經(jīng)元壞死,心肌出血,脾壞死。對照組比免疫保護組的肺組織存在更嚴重的肺不張。
　　 3.豬鏈球菌生物被膜形成機制初步探討及新的毒力相關基因發(fā)掘
　　 通過比較普通培養(yǎng)基和添加纖維蛋白原的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的豬鏈球菌轉錄組的差異來探討豬鏈球菌形成生物被膜的機制。
　　 (1)結果顯示,共有648個基因的表達差異在兩倍以上。其中330個基因表達下調,318個基因表達上調。生物被膜形成的過程中由于周圍營養(yǎng)物質的濃度降低

9、,細菌的生長開始延緩,相應的細菌的代謝速度降低,大量蛋白質合成相關基因,核糖體結構蛋白相關基因,氨基酸合成與轉運相關基因,糖類轉運和代謝相關基因,DNA復制相關基因下調表達。另一方面,細菌通過生物被膜形成,下調表達細胞壁和莢膜多糖合成相關基因,上調表達菌毛輸出相關基因和Sortase基因,溶血素相關基因等,這些基因的上調表達為豬鏈球菌在宿主黏附定植從而建立感染。
　　 (2)對上調表達幅度較大的兩個基因leuD和autolysi

10、n基因繼續(xù)深入研究。通過定量PCR發(fā)現(xiàn),leuD基因在生物被膜形成過程中轉錄上調200倍,與芯片結果趨勢一致。Autolysin也存在一定程度的上調表達,暗示這兩個基因與生物被膜形成密切相關。繼續(xù)構建突變體和回復突變體驗證其功能,結果表明兩個基因對生物被膜形成能力,對Hep-2細胞的黏附和毒力,對豬肺上皮細胞SJPLC細胞系的毒力都顯著下降。最后,豬外周血細胞吞噬試驗證明:autolysin突變株的存活能力相對于野生株的存活能力平均下降