蘋(píng)果MdDRB基因的克隆鑒定和擬南芥AtmiR393α基因在煙草中的異位表達(dá)分析.pdf

1、在擬南芥等模式植物中，DCL1和HYL1等蛋白是miRNA生物合成途徑的關(guān)鍵組分，這些蛋白的一個(gè)共同特征是具有雙鏈RNA結(jié)合域，表明雙鏈RNA結(jié)合蛋白在miRNA合成中具有關(guān)鍵作用。盡管已經(jīng)在幾種果樹(shù)（包括柑橘、葡萄、草莓、蘋(píng)果）中克隆了一些miRNA及其轉(zhuǎn)錄前體序列，但對(duì)果樹(shù)中miRNA轉(zhuǎn)錄前體的加工以及miRNA合成途徑還不清楚。本研究以蘋(píng)果為試驗(yàn)材料，克隆鑒定microRNA合成相關(guān)的雙鏈RNA結(jié)合蛋白基因，并通過(guò)表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因

2、研究鑒定其在miRNA積累和植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能。
　　 另外，一些miRNA的序列和功能在不同植物中高度保守，具有重要功能的擬南芥miRNA基因或前體序列在果樹(shù)基因工程中具有應(yīng)用前景。本研究通過(guò)在煙草中遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥的AtmiR393a基因，驗(yàn)證其異位表達(dá)后的功能保守性，為果樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因利用提供參考。主要結(jié)果如下：
　　 1、蘋(píng)果雙鏈RNA結(jié)合蛋白基因MdDRB的克隆和特征分析
　　 克隆了MdDRB基因

3、的cDNA全長(zhǎng)，總長(zhǎng)度為1853 bp，其中ORF區(qū)域?yàn)?479 bp，編碼一條含492個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)的PI為5.4，分子量為52.2 kDa?；蚪M序列分析表明編碼區(qū)含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，2個(gè)內(nèi)含子分別為919 bp和970 bp，而5'-和3'-UTR區(qū)都沒(méi)有內(nèi)含子的插入。
　　 2、MdDRB編碼雙鏈RNA結(jié)合蛋白
　　 氨基酸序列分析表明，MdDRB蛋白的N端含有2個(gè)雙鏈RNA結(jié)合區(qū)（Ds-DRM），

4、1個(gè)核定位區(qū)（NLS），在其C端含有2段10個(gè)氨基酸殘基重復(fù)序列。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白雙鏈RNA結(jié)合區(qū)的氨基酸序列與大白菜BcpLH的同源性最高，達(dá)75.31％，而與擬南芥AtDRB1（HYL1）的同源性達(dá)72.84％。
　　 MdDRB蛋白的EMSA試驗(yàn)證明，MdDRB蛋白只結(jié)合雙鏈RNA探針，而與單鏈RNA、雙鏈DNA和單鏈DNA探針完全沒(méi)有結(jié)合，并且加入未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性探針后，MdDRB蛋白與標(biāo)記探針的雜交信號(hào)沒(méi)有明顯減弱

5、，表明MdDRB蛋白與雙鏈RNA探針的結(jié)合是非特異性的。
　　 3、MdDRB基因的表達(dá)分析
　　 MdDRB基因的半定量RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR結(jié)果表明，MdDRB基因在檢測(cè)組織和器官中組成型表達(dá)，但表達(dá)水平有差異，在葉片中的表達(dá)量最高，且幼葉的表達(dá)量高于成熟葉。同時(shí)，MdDRB基因的表達(dá)受ABA、鹽和低溫脅迫誘導(dǎo)。
　　 4、MdDRB參與miRNA的合成調(diào)控
　　 microRNA芯片分析和半定

6、量莖環(huán)RT-PCR表明，MdDRB正反義轉(zhuǎn)基因愈傷中的miRNlA形成受到干擾，有的積累增高，有的降低，表明MdDRB參與miRNA合成。
　　 5、MdDRB調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育
　　 無(wú)論是MdDRB轉(zhuǎn)正義基因蘋(píng)果愈傷組織，還是轉(zhuǎn)反義的愈傷組織，其生長(zhǎng)速度都比轉(zhuǎn)空載體的慢。同時(shí)，與野生型番茄相比，正義轉(zhuǎn)基因番茄葉片發(fā)育調(diào)控基因LePROCERAHE和LeLYRATE的表達(dá)水平上調(diào)，并且葉片發(fā)育異常。上述結(jié)果表明，MdDRB在

7、維持細(xì)胞生長(zhǎng)、葉片正常發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 6、AtmiR393基因的異位表達(dá)影響轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)素敏感性
　　 擬南芥AtmiR393a基因在煙草中異位表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)量積累成熟miR393，并下調(diào)靶基因NtTIR1的表達(dá)水平，從而降低轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性，最終導(dǎo)致幼苗生長(zhǎng)和向光性受到抑制，但對(duì)鹽脅迫的耐受性提高。表明煙草中存在與擬南芥相似的miR393轉(zhuǎn)錄后調(diào)控途徑，說(shuō)明了miR393的生物學(xué)功