水貂α和β干擾素基因的克隆表達(dá)及活性分析.pdf

1、干擾素是在特定的誘生劑作用下由淋巴細(xì)胞分泌的具有抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)分化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能等活性的糖蛋白。在動(dòng)物體內(nèi)自身存在的干擾素極其微量，以傳統(tǒng)的方法難以制備和純化，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是解決這一難題的有效途徑。
　　 根據(jù)Genebank上報(bào)道的水貂IFN-α和IFN-β序列設(shè)計(jì)引物，以新鮮水貂肝臟提取的總基因組為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增出IFN-α基因約564bp和和IFN-β基因約561bp兩個(gè)片段，按常規(guī)方

2、法克隆到pMD-18T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切分析獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并進(jìn)一步對(duì)兩片段進(jìn)行序列分析。分別設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增IFN-α基因和IFN-β基因成熟肽的引物，在引物的上下游分別帶有EcoRⅠ、Xho(l)Ⅰ酶切位點(diǎn)，以pMD-IFN-α和pMD-IFN-β為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的片段并且進(jìn)行回收，用相同的限制性內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體pET32a后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-IFN-α和pET32a-IFN-β，并轉(zhuǎn)入E.coliD

3、H5α中，得到基因工程菌，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證明克隆到載體pET32a上的外源基因即為水貂IFN-α和IFN-β成熟肽基因。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE與Westernblot鑒定，可產(chǎn)生相對(duì)分子量約為36KDa和34KDa的表達(dá)產(chǎn)物，表明成功地建立了IFN-α和IFN-β蛋白的重組表達(dá)系統(tǒng)。
　　 對(duì)表達(dá)的蛋白運(yùn)用尿素洗滌的方法進(jìn)行純化，并通過(guò)細(xì)胞病變抑制法測(cè)定干擾