黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3的克隆及其轉(zhuǎn)化黃瓜的研究.pdf

1、黃瓜（CucumissativusL.）是一種重要的世界性蔬菜，也是設(shè)施中的主栽作物之一。其性喜溫，在早春和秋冬季節(jié)，低溫是影響黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子，因此，耐低溫能力的提高成為黃瓜周年供應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而培育高品質(zhì)的耐冷黃瓜品種則是解決這一問題的主要途徑。基因工程不僅可以打破黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄、優(yōu)異基因缺乏的障礙，還具有育種周期短、耗資低、目的性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此，利用轉(zhuǎn)基因的手段為更好、更快的改良黃瓜的耐冷品質(zhì)提供了技術(shù)支持。
　　

2、轉(zhuǎn)錄因子CBF（C-repeatBindingFactor）是植物感受低溫信號(hào)并調(diào)節(jié)自身適應(yīng)性反應(yīng)途徑上最重要的“分子開關(guān)”，該基因可激活下游多個(gè)耐冷相關(guān)功能基因的表達(dá)來提高植物對(duì)低溫的抗性。鑒于其在植物耐冷過程中的重要作用，克隆黃瓜CBF3基因并研究其在低溫脅迫下的表達(dá)情況，可明確該基因在黃瓜中的功能，進(jìn)一步闡釋黃瓜耐冷的分子機(jī)理。同時(shí)利用基因工程技術(shù)將其轉(zhuǎn)入黃瓜中可顯著提高黃瓜的耐冷能力，為黃瓜耐冷育種提供新的種質(zhì)資源。
　　

3、基于上述背景及意義，本文克隆了黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3基因并開展了相關(guān)的遺傳轉(zhuǎn)化研究，具體內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3的克隆及表達(dá)分析
　　利用RT-PCR技術(shù)從黃瓜中克隆了CsCBF3基因，GenBank登錄號(hào)為JQ900769。CsCBF3基因開放閱讀框全長為615bp，編碼204個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹分析表明CsCBF3隸屬于CBF基因家族，與葡萄CBF3蛋白親緣關(guān)系最近。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CsC

4、BF3編碼的蛋白包含保守的AP2DNA結(jié)合域，N端的核定位信號(hào)區(qū)和C端的酸性氨基酸富集區(qū)。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示低溫可誘導(dǎo)CsCBF3的表達(dá)，且其表達(dá)量在迅速達(dá)到峰值后又降低，說明CsCBF3是一個(gè)快速響應(yīng)基因，推測(cè)其在黃瓜耐冷過程中起著重要的作用。
　　2.乙酰丁香酮及共培養(yǎng)pH對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響
　　以黃瓜品種‘長春密刺’子葉節(jié)為外植體，研究了乙酰丁香酮的添加方式、濃度及共培養(yǎng)pH值對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。試

5、驗(yàn)結(jié)果表明:在菌液和共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮均可顯著提高黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率，濃度以100μmol/L效果最佳。不同的共培養(yǎng)pH條件對(duì)黃瓜抗性芽誘導(dǎo)率也有影響，在pH5.2的共培養(yǎng)基上黃瓜轉(zhuǎn)化率最高。
　　3.CsCBF3基因表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)黃瓜的轉(zhuǎn)化
　　根據(jù)CsCBF3基因的開放閱讀框序列設(shè)計(jì)特異引物，利用雙酶切的方法將CsCBF3基因插入到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1304上，并通過凍融法把重組質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌株E