中華絨螯蟹cDNA文庫的構(gòu)建及免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、中華絨螯蟹是我國具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)品。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大及環(huán)境的惡化，各種由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原引起的疾病頻繁發(fā)生，給中華絨螯蟹的養(yǎng)殖帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究借助分子生物學(xué)手段，首先通過構(gòu)建脂多糖刺激的中華絨螯蟹cDNA文庫，在此基礎(chǔ)上，篩選出一些與免疫相關(guān)的基因序列，并通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步對主要免疫相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析，為中華絨螯蟹的免疫機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。結(jié)果

2、如下：
　　 1.運(yùn)用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了庫容量為6.28×106，重組率為95.8％，平均插入片段為700bp的脂多糖刺激的中華絨螯蟹cDNA文庫，從文庫中挑取cDNA克隆進(jìn)行測序，總共進(jìn)行了319個成功反應(yīng)，獲得140個包含重疊群的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，使用BLAST軟件將這些序列同GenBank等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對、查詢和注釋，結(jié)果顯示121條序列有相關(guān)同源性，獲得了一些會在中華絨螯蟹的免疫反應(yīng)中起著重要作用基因的EST

3、s，為中華絨螯蟹免疫相關(guān)基因的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.C型凝集素是一個具有糖識別結(jié)構(gòu)域的超家族，在無脊椎動物的先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。在前期構(gòu)建中華絨螯蟹cDNA文庫時獲得的兩個C型凝集素的EST序列的基礎(chǔ)上，采用RACE方法擴(kuò)增了這兩個基因的cDNA序列。中華絨螯蟹C型凝集素A(EsLecA)其全長為772bp，包含462bp的開放閱讀框，推測編碼的蛋白質(zhì)為153aa，其5′和3′端的非編碼區(qū)分別為175bp和135

4、bp；C型凝集素B(EsLecB)其全長為700bp，包含504bp的開放閱讀框，推測編碼的蛋白質(zhì)為167aa，其5′和3′端的非編碼區(qū)分別為24bp和172bp。通過熒光定量PCR的方法研究了EsLecA和EsLecB基因在中華絨螯蟹的組織表達(dá)分布以及經(jīng)脂多糖和PolyI:C刺激后在血淋巴、腸、鰓和肝胰腺組織中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)EsLecA和EsLecB基因主要在肝胰腺中表達(dá)。與對照組相比，腸、鰓和肝胰腺在脂多糖和PolyI:C免疫后E

5、sLecA表達(dá)量均表現(xiàn)上調(diào)；與對照組相比，血淋巴、腸、鰓和肝胰腺在脂多糖和PolyI:C免疫后EsLecB表達(dá)量均表現(xiàn)上調(diào)。
　　 3.鐵蛋白是普遍存在于生物體內(nèi)，具有鐵離子解毒和儲存等功能的蛋白，在構(gòu)建脂多糖刺激的中華絨螯蟹cDNA文庫的基礎(chǔ)上，獲得了中華絨螯蟹鐵蛋白基因EsFer的cDNA序列，其全長為1,118bp，包含480bp的開放閱讀框，推測編碼的蛋白質(zhì)為159aa，其5′和3′端的非編碼區(qū)分別為178bp和461b