馬鈴薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因的分子克隆及其在畢赤酵母菌中的表達(dá).pdf

1、傳統(tǒng)的乙醇是利用糧食通過(guò)高溫蒸煮發(fā)酵的方法生產(chǎn)，考慮到傳統(tǒng)酒精發(fā)酵工業(yè)高能耗、原料缺乏、高污染、發(fā)酵酒精度偏低等弊端。本實(shí)驗(yàn)選擇了以馬鈴薯淀粉為發(fā)酵原料，生產(chǎn)乙醇符合國(guó)家節(jié)能減排的產(chǎn)業(yè)政策。利用基因操作技術(shù)克隆了馬鈴薯來(lái)源的α-淀粉酶基因以及具有黑曲霉來(lái)源的耐酸耐高溫γ-淀粉酶基因，經(jīng)體外構(gòu)建后分別導(dǎo)入酵母菌，獲得了可有效降解馬鈴薯淀粉的轉(zhuǎn)基因畢赤酵母工程菌，通過(guò)接種釀酒酵母厭氧發(fā)酵獲得乙醇。
　　 實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下：

2、>　　 1、以夏波蒂馬鈴薯總RNA為模板，根據(jù)α-淀粉酶基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了引物，通過(guò)RT-PCR法獲得α-淀粉酶基因(amyA)，利用平末端克隆技術(shù)將其克隆至pET32a上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因全長(zhǎng)1224 bp，編碼406個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析54-1224bp為編碼成熟肽基因，又設(shè)計(jì)了引物克隆獲得成熟肽基因(Namy)，同時(shí)將其亞克隆至pPIC9k，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pkamyA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，利用錐蟲(chóng)藍(lán)法

3、篩選獲得高表達(dá)淀粉酶活性菌株GSamyA5，對(duì)該菌株進(jìn)行培養(yǎng)，0.5％(v/v)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h，利用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)上清液，發(fā)現(xiàn)GSamyA5表達(dá)的特異蛋白條帶，約為42kDa。對(duì)重組粗酶酶學(xué)性質(zhì)分析表明：該酶作用的最適pH值為6.0，最適作用溫度為45℃，熱穩(wěn)定性及抗酸堿性較差，且金屬離子Ca2+、K+、Zn2+對(duì)其酶活有促進(jìn)作用，而Cu2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用。
　　 2、以黑曲霉總RNA為模板，根

4、據(jù)γ-淀粉酶基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了引物，通過(guò)RT-PCR法獲得γ-淀粉酶基因(amyC)，利用平末端克隆技術(shù)將其克隆至pET32a上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因全長(zhǎng)1996bp，編碼604個(gè)氨基酸。同時(shí)將其亞克隆至pPIC9k，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pkamyC轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，利用錐蟲(chóng)藍(lán)法篩選獲得高表達(dá)淀粉酶活性菌株GSamyC3，對(duì)該菌株進(jìn)行培養(yǎng)，0.5％(v/v)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h，利用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)上清液，發(fā)現(xiàn)G

5、SamyC3表達(dá)的特異蛋白條帶，約為68kDa。對(duì)重組粗酶酶學(xué)性質(zhì)分析表明：該酶作用的最適pH值為4.6，最適作用溫度為60℃，熱穩(wěn)定性及抗酸堿性良好，且金屬離子Ca2+、Na+對(duì)其酶活行促進(jìn)作用，而Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用。
　　 3、以馬鈴薯淀粉為原料，按1％接種量分別接種轉(zhuǎn)α-淀粉酶基因和γ-淀粉酶基因酵母工程菌，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)36h后二次接種轉(zhuǎn)γ-淀粉酶基因酵母菌，再添加5％釀酒酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵，生