葡萄果粒大小候選基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、葡萄遺傳背景復(fù)雜,育種周期長,常規(guī)育種方法較難實(shí)現(xiàn)品種改良,隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,把目的基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi),可在不改變多種優(yōu)良性狀的前提下定向改良某些性狀,提高育種效率,為葡萄的育種改良提供了一條新途徑。
　　 葡萄再生頻率低是造成葡萄遺傳轉(zhuǎn)化困難的關(guān)鍵因素之一。本研究以優(yōu)良釀酒葡萄品種葛海娜(Grenache）、霞多麗(Chardonnay）、西臘(Syrah)為試材,對(duì)影響離體莖段不定芽誘導(dǎo)的因素,如基因型、接種外植體類

2、型、基本培養(yǎng)基類型、生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比、接種方式以及培養(yǎng)條件等進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究,建立了葛海娜離體莖段再生體系,為釀酒葡萄遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。
　　 葡萄果實(shí)大小是與產(chǎn)量和市場需求密切相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀。大粒葡萄具有重要的商業(yè)價(jià)值,是鮮食葡萄的主要育種目標(biāo)之一。雖然噴灑赤霉素能適當(dāng)增大果粒,但增加了管理工序及成本。
　　 本研究采用電子克隆策略,以番茄已知果實(shí)大小控制基因ORFX(GenBank登錄號(hào):AF2617

3、75)為信息探針,依托葡萄EST數(shù)據(jù)庫和基因組信息,采用生物信息學(xué)方法,通過同源篩選.結(jié)合RT-PCR技術(shù),克隆了控制葡萄果實(shí)大小的候選基因（EX);構(gòu)建了兩種植物表達(dá)載體.即過量表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體（反義載體).并進(jìn)行了初步的遺傳轉(zhuǎn)化研究。
　　 本試驗(yàn)不僅為闡明果實(shí)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ).而且對(duì)獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新基因具有重要意義.同時(shí)對(duì)有效開展葡萄果實(shí)大小重要性狀的分子育種,提高葡萄的產(chǎn)量及商業(yè)價(jià)值具有很重要的實(shí)

4、踐意義。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.基因型是影響葡萄離體莖段再生的重要因素,研究結(jié)果表明:葛海娜品種的不定芽誘導(dǎo)效率顯著高于西臘和霞多麗品種;通過對(duì)不同培養(yǎng)基的篩選,確定了MS為葛海娜離體莖段誘導(dǎo)不定芽的最適基本培養(yǎng)基;葛海娜、霞多麗和西臘三種基因型中,僅從莖段外植體誘導(dǎo)出不定芽,而葉片和葉柄外植體均未能誘導(dǎo)出不定芽;莖段不同接種方式對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果有顯著影響:葛海娜離體莖段最適再生培養(yǎng)基為:MS+BA1.0

5、mg/L+IBA0.01mg/L,不定芽誘導(dǎo)率為27％,適宜的暗培養(yǎng)時(shí)間為15d左右。
　　 2.采用電子克隆策略,從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的核酸數(shù)據(jù)庫檢索到番茄的果實(shí)大小控制基因ORFX(L.pennelliiAF261775),以該序列為信息探針,運(yùn)行Proteinqueryvstranslateddatabase(tblastn)程序,BLAST檢索est-others數(shù)據(jù)庫,得到一條同源

6、性很高的葡萄EST序列(GenBank登錄號(hào):FC062660.1)作為種子序列。根據(jù)該EST的堿基序列,結(jié)合生物信息學(xué)分析,我們認(rèn)為所得到的EST序列就是一個(gè)完整的CDS。因此,我們把獲得的EST暫時(shí)命名為EX。
　　 3.過量表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)已知EX基因序列設(shè)計(jì)引物,通過PCR擴(kuò)增獲得EX基因。PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,篩選出正向陽性克隆pMD19-EX,對(duì)pMD19-EX和pCAMBIA1301s載體（載

7、體pCAMBIA1301s帶有2×35s雙啟動(dòng)子）分別進(jìn)行KpnI和Sa/I雙酶切,回收后用T4連接酶連接,經(jīng)PCR和酶切鑒定,表明成功構(gòu)建了過量表達(dá)載體,命名為命名為pC1300S-SEX。
　　 4.抑制表達(dá)載體的構(gòu)建（反義表達(dá)載體的構(gòu)建）篩選出反向連入pMD19-T克隆載體的陽性克隆(反向pMD19-EX),對(duì)其和pCAMBIA1301s載體分別進(jìn)行KpnI和SalI雙酶切后回收用T4連接酶連接,經(jīng)PCR和酶切鑒定,表明成

8、功構(gòu)建了反義表達(dá)載體,命名為pC1301S-AEX。
　　 5.通過凍融法將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105后,進(jìn)行了葡萄遺傳轉(zhuǎn)化研究。將葛海娜莖段外植體經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后,轉(zhuǎn)到MS+BA0.5mg/L+IBA0.01mg/L+Hyg1mg/L篩選培養(yǎng)基上,經(jīng)22d后,大部分不定芽褐化死亡,只得到5個(gè)Hyg抗性的不定芽。將抗性芽接種于生根培養(yǎng)基中,得到了抗性小植株。由于在篩選、生根過程中一些抗性植株未能成活,因此本研究最終獲得了1株抗