牛微小隱孢子蟲CP15抗原高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析及其GST融合表達載體的構(gòu)建.pdf

1、隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis）是由隱孢子蟲（Cryptosporidium）引起的全球性人畜共患寄生蟲病。微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)是該病的主要病原體，它是屬于頂端復(fù)合物門的寄生性原蟲，可引起人和多種動物的嚴(yán)重腹瀉，是引起免疫缺陷病人死亡的主要原因之一。所有被感染的生物體都會通過糞便向環(huán)境排泄隱孢子蟲卵囊，而這些卵囊主要通過污染水源，如飲用水、游泳池、河流、湖泊等再感染其他人和動物，故

2、對人類公共衛(wèi)生造成很大威脅。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲功能性抗原基因主要有7種，其中對編碼子孢子表面抗原的基因的研究最為深入，主要有Cp15、Cp23、Cp15/60等抗原。雖然很多研究者對本病的防治進行了大量的研究，但至今尚無一種行之有效的防治方法，因此研究該病的診斷試劑和疫苗迫在眉睫。
　　本研究利用PCR方法，從已經(jīng)構(gòu)建的隱孢子蟲子孢子cDNA文庫中克隆出子孢子抗原Cp15基因，將其克隆到pMD19（T）載體中，

3、命名為pMD19－Cp15。對篩選出的陽性克隆進行基因序列測序和分析，應(yīng)用生物學(xué)分析軟件 ExpasyProtparam(http://web.expasy.org/protparam)、Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)、SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmL)和Psipred

4、（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）等對Cp15基因序列和氨基酸序列進行預(yù)測分析，并用Swiss-PdbViewer等三種軟件對CP15蛋白進行了高級結(jié)構(gòu)預(yù)測，為獲得有效的基因片段提供了理論依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cp15基因可編碼126個氨基酸殘基的多肽，預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為14.79 KDa，理論等電點為4.84，親水氨基酸比例達到59.5％。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)可能具有2個螺旋區(qū)，無規(guī)則卷曲和線性結(jié)構(gòu)構(gòu)

5、成二級結(jié)構(gòu)的主要成分，B細胞表位可能處于50-58、76-89、110-115等幾個肽段。此外，將pMD19－CP15經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切處理后的Cp15基因，定點克隆到pGEX4T-3載體中，構(gòu)建了大腸桿菌中GST融合表達的重組載體pGEX-Cp15，將其轉(zhuǎn)入到E.coli BL21中，并用IPTG進行誘導(dǎo)表達融合蛋白質(zhì) GST-CP15。對融合 CP15蛋白的表達情況進行SDS-PAGE電泳和Wester-blotting鑒