豬巨細(xì)胞病毒gB基因序列分析及原核表達(dá).pdf

1、根據(jù)Genbank中豬巨細(xì)胞病毒DPOL基因序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增片段大小為579bp的引物P1/P2，建立了檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒PCR方法。引物P1/P2從PCMV陽(yáng)性DNA模板中擴(kuò)增出特異性條帶的最低DNA含量為10-2 ng/mL。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與NCBI中已發(fā)表的豬巨細(xì)胞病毒OF-1株序列(AF268041)的同源性為99％。用該方法對(duì)全國(guó)11個(gè)省市地區(qū)豬場(chǎng)的100份臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果有33份樣品檢測(cè)出陽(yáng)性，陽(yáng)性率為33％

2、。
　　 應(yīng)用PCR方法，從鄭州、福建、浙江金華和寧波豬肺臟中分別擴(kuò)增出四段PCMV gB基因，并將其分別克隆入pMD18-T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。序列分析表明，其gB基因全長(zhǎng)為2580 bp，編碼860個(gè)氨基酸，與PCMV其他序列相比，其同源性在96.1％～99.7％，與β皰疹病毒亞科中其他常見(jiàn)毒株同源性在25.9％～38.1％:推導(dǎo)的氨基酸序列，有11個(gè)半胱氨酸，17個(gè)潛在N

3、-糖基化位點(diǎn)，其裂解位點(diǎn)是RYKR;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，推導(dǎo)的氨基酸序列出現(xiàn)兩個(gè)分支，而且來(lái)自上述四個(gè)地區(qū)PCMV gB糖蛋白氨基酸序列處在不同的分支中。
　　 根據(jù)已發(fā)表的NB PCMV gB基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物.擴(kuò)增引物上下游分別帶有BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)。PCR獲得目的片段，并將其克隆到pMD18-T載體。用相同的限制性內(nèi)切酶酶切陽(yáng)性重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pGEX-6P-1后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pG