弓形蟲自殺性DNA疫苗及重組桿狀病毒疫苗研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)廣泛存在于世界各地,寄生于人和200多種脊椎動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)而引起人獸共患弓形蟲病(Toxoplasmosis)。該病嚴(yán)重影響人類優(yōu)生優(yōu)育與畜牧業(yè)的健康發(fā)展。目前弓形蟲病的防治主要依靠藥物防治,但藥物防治無法從根本上清除宿主體內(nèi)的弓形蟲,僅僅是將弓形蟲從快速繁殖的速殖子轉(zhuǎn)變?yōu)榫徛敝车木徶匙?一旦宿主的免疫功能出現(xiàn)障礙,弓形蟲將從緩殖子再度活化為速殖子。因此研制安全高效的新型疫苗來預(yù)防和控

2、制弓形蟲病成為各國研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。但由于弓形蟲的生活史復(fù)雜,影響免疫的因素多,目前弓形蟲病的免疫預(yù)防研究進(jìn)展不大。
　　 本研究對(duì)弓形蟲病兩種新型疫苗進(jìn)行了探索,構(gòu)建了“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3和重組桿狀病毒疫苗Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1,并在實(shí)驗(yàn)鼠模型BALB/c上對(duì)構(gòu)建的候選疫苗進(jìn)行了免疫效力研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.弓形蟲“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3的構(gòu)建及免疫原性研究

3、
　　 DNA疫苗具有高效、穩(wěn)定、易構(gòu)建等優(yōu)點(diǎn)被研究者認(rèn)為是最有潛力的新型疫苗,但DNA疫苗免疫后長(zhǎng)期存在于宿主體內(nèi),一旦整合進(jìn)宿主染色體可能會(huì)引起宿主基因的改變,另外宿主體內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該DNA疫苗的抗體,因此存在很大的安全隱患。基于甲病毒復(fù)制子的自殺性DNA疫苗繼承了DNA疫苗的上述優(yōu)點(diǎn),但它能隨宿主細(xì)胞的凋亡自我凋亡,同時(shí)具有免疫增強(qiáng)的作用,因此被認(rèn)為是一種優(yōu)良的新型疫苗載體。
　　 本研究從弓形蟲全基因組中利用

4、PCR擴(kuò)增弓形蟲MIC3全基因,并克隆到“自殺性DNA疫苗”質(zhì)粒載體pSAG1和常規(guī)DNA疫苗載體pcDNA3.1+中,獲得“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3和常規(guī)DNA疫苗pcDNA-MIC3。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明pSCA-MIC3和pcDNA-MIC3均能夠介導(dǎo)弓形蟲MIC3基因在BHK-21細(xì)胞中有效表達(dá)。將該疫苗與常規(guī)DNA疫苗pcDNA-MIC3分別以50ug和100ug免疫六周齡BALB/C鼠,試驗(yàn)

5、結(jié)果表明,在首疫后兩周pSCA-MIC3、pcDNA-MIC3均能利用ELISA檢測(cè)到微弱的抗弓形蟲MIC3抗體,第四周,第六周加強(qiáng)免疫后兩組的抗體水平繼續(xù)升高,但pSCA-MIC3、pcDNA-MIC3兩組之間抗體水平差異不顯著,PBS和空載體對(duì)照組均檢測(cè)不到MIC3抗體的存在。細(xì)胞免疫水平檢測(cè)表明pSCA-MIC3、pcDNA-MIC3免疫組的BALB/c鼠誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖、IFN-γ的表達(dá)均顯著高于PBS和空載體對(duì)照組,但pSC

6、A-MIC3、pcDNA-MIC3兩組之間細(xì)胞免疫水平差異不顯著。使用弓形蟲RH株攻擊時(shí)二者均能顯著延長(zhǎng)BALB/c鼠的存活時(shí)間。以上研究結(jié)果表明“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3具有良好的免疫原性,同時(shí)其隨宿主細(xì)胞自我凋亡的特性導(dǎo)致它比常規(guī)的DNA疫苗有著更高的安全性,是一種極具潛力的弓形蟲候選疫苗。
　　 2.弓形蟲重組桿狀病毒疫苗Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1的構(gòu)建及免疫原性的研究
　　 在合適的啟動(dòng)子

7、驅(qū)動(dòng)下,桿狀病毒可以在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因,但自身并不感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。但桿狀病毒介導(dǎo)外源基因表達(dá)的能力在一定程度上受到血清補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制,從而影響桿狀病毒疫苗的應(yīng)用。水泡性口炎病毒G蛋白的引入,可以消除桿狀病毒對(duì)補(bǔ)體的敏感性。因此利用哺乳動(dòng)物極早期啟動(dòng)子CMV驅(qū)動(dòng)的,水泡性口炎病毒G蛋自修飾的桿狀病毒載體pFast-VSV-G-CMV(Ac-V)成為一種優(yōu)良的疫苗載體。
　　 本研究分別將弓形蟲的MIC3、SAG1基

8、因插入桿狀病毒載體pFast-VSV-G-CMV構(gòu)建了重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1均能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物PK-15細(xì)胞。將重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1分別以不同的劑量(1010pfu/mL,109pfu/mL,108pfu/mL)免疫BALB/c鼠,試驗(yàn)結(jié)果表明,在首免后第三周,重組病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1

9、免疫組和相應(yīng)的DNA疫苗對(duì)應(yīng)組均可檢測(cè)到特異的抗弓形蟲ELISA抗體,二次免疫之后,重組病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1免疫組ELISA平均抗體水平隨之升高,均顯著的高于其它對(duì)照組。重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1免疫組的細(xì)胞免疫水平同樣顯著高于對(duì)照組,重組病毒1010pfu/mL免疫組表現(xiàn)出最高的體液和細(xì)胞免疫水平,顯著高于108pfu/mL免疫組和DNA疫苗對(duì)照組。使用弓形蟲RH株攻擊時(shí)重組病毒1010p