DRE、W和S盒在轉(zhuǎn)基因水稻中的作用分析.pdf

1、植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了誘導(dǎo)型防御反應(yīng)機(jī)制,使以消耗物質(zhì)和能量為代價(jià)的防御反應(yīng)限制在特定的時(shí)間或空間,以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和能量的有效利用。防御反應(yīng)基因應(yīng)答逆境脅迫主要由防御反應(yīng)基因啟動(dòng)子中的順式作用元件與其相應(yīng)的反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)的識(shí)別和結(jié)合所控制,因此,分離、分析應(yīng)答特定逆境的順式作用元件不僅有利于進(jìn)一步分離其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子闡明誘導(dǎo)型防御反應(yīng)的信號(hào)傳遞通路,還有利于應(yīng)用這些元件構(gòu)建誘導(dǎo)型人工合成啟動(dòng)子用于植物抗逆基因工程遺傳改良

2、。本研究對(duì)前人從雙子葉植物中分離、鑒定出來(lái)的DRE盒、W盒和S盒元件在水稻中應(yīng)答不同逆境的作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,主要結(jié)果如下:
　　 1、采用常規(guī)的酶切連接技術(shù)與gateway克隆技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建了一套將DRE盒、w盒和S盒等參試順式作用元件插入到CaMV35S核心啟動(dòng)子(+8bp--46bp)的上游,控制GUS報(bào)告基因表達(dá)的植物表達(dá)載體,通過(guò)測(cè)序?qū)ι鲜鲚d體進(jìn)行了驗(yàn)證；
　　 2、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法分別將上

3、述載體轉(zhuǎn)入粳稻日本晴中,獲得了上述載體相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因TO代植株,對(duì)上述TO代植株在溫室栽培并進(jìn)行自交純合和潮霉素浸種篩選,分別獲得其足夠的T1和T2代株系。
　　 3、利用上述轉(zhuǎn)基因株系的種子、植株或其衍生的抗性愈傷組織,采用低溫、高溫、鹽脅迫、稻縱卷葉螟取食和稻瘟病接種等方法處理結(jié)合GUS組織化學(xué)染色的分析方法,分析了DRE盒、W盒和S盒元件在轉(zhuǎn)基因水稻中對(duì)參試的不同逆境脅迫的應(yīng)答,并分析了不同元件對(duì)上述逆境脅迫應(yīng)答與幾種內(nèi)源激

4、素信號(hào)之間的可能關(guān)系:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),w盒可介導(dǎo)水稻對(duì)真菌性病害稻瘟病的應(yīng)答,參與了對(duì)稻縱卷葉螟取食的應(yīng)答,還可能與JA和SA信號(hào)途徑關(guān)系。DRE盒驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)對(duì)各種逆境的應(yīng)答很弱甚至沒(méi)有表達(dá),說(shuō)明在單子葉植物水稻中順式作用元件與反式作用因子之間的識(shí)別和互作與其側(cè)翼序列有關(guān)。S盒可明顯介導(dǎo)水稻對(duì)稻瘟病和稻縱卷葉螟的應(yīng)答,對(duì)各種非生物逆境的應(yīng)答水平不同,而對(duì)外源激素有一定的表達(dá)。
　　 4、選擇對(duì)病原菌或誘發(fā)因子處理高效應(yīng)答的元

5、件,選擇合適的拷貝數(shù)以及適宜的組合,構(gòu)建含多個(gè)順式作用元件組合(2×DRE+2×GCC+2×JERE+2×W)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因TO代植株,并對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR分子鑒定。
　　 本研究的初步研究結(jié)果表明,在單子葉水稻和雙子葉植物之間,順式作用元件與其反式作用因子之間的識(shí)別和互作激活植物防御反應(yīng)存在著一定程度的保守性,W盒和S盒在稻瘟病和稻縱卷葉螟等生物性逆境脅迫具有較強(qiáng)的應(yīng)答作用