中華蜜蜂王漿抗菌肽Acc-royalisin原核表達(dá)及抑菌活性研究.pdf

1、中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國(guó)土生土長(zhǎng)的蜂種，其抗病性明顯優(yōu)于西方蜜蜂(Apismellifera)。蜂王漿是哺育工蜂的咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體分泌的乳狀、具有生物活性的活性物質(zhì)。近期的研究表明，中華蜜蜂抗病性優(yōu)于西方蜜蜂以及蜂王漿不易變質(zhì)的特性都與中華蜜蜂王漿抗菌肽Apis cerana cerana—royalisin(Acc—royalisin)有關(guān)。Prepro—Acc—royalisn(PPAR)是

2、Acc—royalisin前體，Mature Acc—royalisin(MAR)為Acc—royalisin的成熟肽部分。
　　 1．Prepro—Acc—royalisn原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 以含蜂王漿抗菌肽Prepro—Acc—royalisn(PPAR)基因的中華蜜蜂頭部cDNA文庫(kù)質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴(kuò)增出其前體片段，將該片段克隆入表達(dá)載體pGEX—4T—2，其C端與GST連接。在大腸桿菌BL2

3、1中與GST進(jìn)行融合表達(dá)。利用割膠回收獲得目的蛋白注射兔子，制備多克隆抗體。SDS—PAGE和薄層掃描分析結(jié)果表明：該基因得到高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為46kDa，占細(xì)胞總蛋白的16.3％。利用所獲抗體對(duì)純化PPAR融合蛋白進(jìn)行Western blot印跡分析，獲得特異性條帶。結(jié)果證明，該抗體可用于檢測(cè)Acc—royalisin的存在。
　　 2．Mature Acc—royalisin的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析
　　

4、 本試驗(yàn)完成了對(duì)Mature Acc—royalisin(MAR)的基因克隆、原核表達(dá)及產(chǎn)物的可溶性分析。Westernbolt分析結(jié)果表明MAR成功在大腸桿菌中成功的與GST進(jìn)行了融合表達(dá)，表達(dá)的GST—MAR占表達(dá)總蛋白的18.6％，其中可溶性部分占90％以上。
　　 3．GST—Prepro—Acc—royalisn、GST—Acc—royalisin純化及Acc—royalisin蛋白的獲得
　　 本實(shí)驗(yàn)利用G

5、enScript Corporation蛋白純化試劑盒，將獲得的GST—PPAR及GST—MAR的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別在500mL的菌液中純化出0.0134g及and0.0206g蛋白。Westernbolt印跡表明，純化的三種蛋白GST—PPAR、GST—MAR和GST均對(duì)GST一抗產(chǎn)生了很強(qiáng)的特異性的反應(yīng)，證明GST—PPAR、GST—MAR融合蛋白純化成功。同時(shí)，將純化后的GST—MAR用凝血酶酶切獲得了單體MAR。

6、　　 4．Acc—royalisin重組表達(dá)產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑菌活性研究
　　 用GST—PPAR，PPAR及MAR的純化產(chǎn)物分別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，黃色微球菌Micrococcus luteus和枯草芽孢桿菌Bacillus subalis．進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明：三種純化產(chǎn)物對(duì)這三類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌均有拮抗作用，且效果明顯，與屬于具有防腐功能的商品化食品添加劑—抗菌