滬杭地區(qū)番茄上黃瓜花葉病毒基因多態(tài)性的研究.pdf

1、番茄病毒病是危害我國番茄產量與質量的主要原因,導致我國番茄病毒病的主要病毒為黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV),二者可以單獨侵染也可以復合侵染。番茄病毒病的發(fā)生與病毒種類、地域和季節(jié)具有相關性。夏秋兩季為番茄病毒病的高發(fā)季節(jié),本研究于滬杭地區(qū)不同地點采集具有差異性癥狀的田間番茄樣品,檢測侵染該地區(qū)番茄的病毒,并對主要毒源CMV作詳細分類與研

2、究。本文利用多重RT-PCR方法和DAS-ELISA檢測侵染番茄的病毒,并對主要毒源CMV進行酶切圖譜差異性分析,進而應用dsRNA-SPAT方法對幾類典型CMV分離物克隆測序并進行序列分析。
　　 受病毒侵染的田間番茄主要癥狀分為四類:重花葉、線性葉、輕花葉和葉片卷曲。本文采集具有上述癥狀的番茄樣品,應用DAS-ELISA方法檢測CMV、ToMV、TMV、TAY、PVX、PVY、ToRSV和TSWV等。并且運用以植物18SrR

3、NA為內參的多重RT-PCR方法,同時檢測CMVⅠ、CMVⅡ及CMV攜帶的sat RNA,以及TMV和ToMV等病毒,實現(xiàn)了屬間檢測。結果表明侵染該地區(qū)田間番茄的主要毒源為CMV和ToMV,且存在復合侵染現(xiàn)象。CMV所占比例大于ToMV,CMV亞組Ⅰ占主要地位,同時檢測到攜帶satRNA的CMV樣品。通過與DAS-ELISA檢測結果及靈敏性試驗比較,說明多重RT-PCR為一種靈敏性高,準確度好的檢測方法。
　　 將檢測到CMV的

4、番茄樣品轉接心葉煙與合作903番茄,培養(yǎng)于溫室保存毒源。根據(jù)癥狀差異和多重。RT-PCR檢測結果,根據(jù)RNA3類別選取5個CMV亞組Ⅰ和1個CMV亞組Ⅱ樣品進行基于RT-PCR的限制性酶切分析。該方法不僅可以鑒定CMV亞組Ⅰ和亞組Ⅱ株系之間的復合侵染,也可以對不同CMV株系的三條基因組RNA鏈進行快速分組鑒定,檢測是否存在天然假重組現(xiàn)象。酶切結果顯示:5個CMV亞組Ⅰ樣品中,RNA1和RNA2均與CMV亞組Ⅰ標準株系酶切結果相同,sc3

5、,sc7,xs15的RNA3與CMV亞組ⅠB、xs11的RNA3與CMV亞組ⅠA的酶切結果一致,但是sc20的RNA3片段酶切后沒有變化,推測sc20的RNA3上限制性酶MspⅠ作用位點發(fā)生了變化;CMV亞組Ⅱ樣品的3條基因組片段酶切結果均與CMV亞組Ⅱ標準株系一致。限制性酶切分析結果表明樣品中沒有假重組現(xiàn)象存在。
　　 用于限制性酶切分析的樣品轉接合作903番茄后提取dsRNA,通過單引物擴增法(SPAT)獲得擴增片段,克隆測

6、序獲得樣品RNA3的全長序列。同源性結果顯示,樣品xs11的RNA3與其他四個CMV亞組Ⅰ樣品相比,與CMV亞組ⅠA具有較高的同源性,xs16的RNA3與CMV亞組Ⅱ同源性較高。進化樹分析結果與同源性比對結果基本一致。序列分析及酶切位點比對結果顯示,sc20 RNA3的CP基因在MspⅠ作用位點發(fā)生點突變,喪失了酶切位點,因此sc20的RNA3經MspⅠ作用后片段沒有發(fā)生變化,與推測一致。
　　 綜上所述,侵染滬杭地區(qū)田間番茄的