甘藍(lán)型油菜BnPPT1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator1PPT1)是細(xì)胞質(zhì)體碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)關(guān)鍵基因,在植物莽草酸代謝和脂肪酸生物合成途徑中起著重要作用。根據(jù)模式植物擬南芥PEP轉(zhuǎn)運(yùn)子AtPPT1基因序列與油菜數(shù)據(jù)庫BBSRC BrassicaDB中相應(yīng)ESTs設(shè)計(jì)全長引物,以甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)幼嫩葉片基因組DNA和種子cDNA為模板,克隆甘藍(lán)型

2、油菜PEP轉(zhuǎn)運(yùn)子基因全長序列,命名為BnPPT1。該基因gDNA全長為2075bp,含有8個(gè)內(nèi)含子,編碼區(qū)長度為1224bp,編碼407個(gè)氨基酸。序列比對表明,BnPPT1與同屬于十字花科擬南芥AtPPT1轉(zhuǎn)運(yùn)子同源性很高,僅有個(gè)別氨基酸的差異；進(jìn)化分析結(jié)果進(jìn)一步說明兩者近親緣關(guān)系。以BnPPT1全長cDNA為目標(biāo)序列,構(gòu)建組成性強(qiáng)啟動子CamV35S驅(qū)動的與報(bào)告基因eGFP融合的植物表達(dá)載體BPE,同時(shí)以-401bp的BnPPT1片斷

3、為靶片斷,構(gòu)建CamV35S啟動子驅(qū)動的RNAi載體BPTi,通過花粉管浸泡法導(dǎo)入到擬南芥,進(jìn)行融合蛋白亞細(xì)胞定位觀察以及功能表達(dá)驗(yàn)證；亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明BnPP71基因編碼蛋白與ATPPT1蛋白一樣定位于細(xì)胞質(zhì)體,且以BnPPT1基因部分cDNA片斷構(gòu)建的RNAⅰ載體BPTⅰ的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出內(nèi)源基因AtPPT1的表達(dá)抑制,出現(xiàn)了明顯的低葉綠素表型,而BPE轉(zhuǎn)基因能完全恢復(fù)AtPPT1基因功能缺失擬南芥突變體表型。這些研究結(jié)果不

4、僅說明了BnPPT1基因與擬南芥AtPPT1基因高度同源,同時(shí)也表明兩者可能具有相同的生物學(xué)功能,由此推測在甘藍(lán)型油菜中,BnPPT1基因具有提供油脂/蛋白質(zhì)生物合成的重要底物PEP這一十分重要的生物學(xué)作用。采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表達(dá)差異很大,在幼嫩的子葉、莖以及中早期發(fā)育時(shí)期種子中有較高豐度的表達(dá),在種子中表達(dá)豐度隨發(fā)育時(shí)期逐步升高。但在成熟后期沒有表達(dá),暗示該基因在油菜籽粒油份等物質(zhì)積累中有重

5、要功能。因此,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染油菜下胚軸的技術(shù),將構(gòu)建好的BPE載體導(dǎo)入了本研究室前期獲得高油份甘藍(lán)型油菜中,PCR檢測以及除草劑抗性篩選表明成功獲得了轉(zhuǎn)基因陽性株系32份；T0代單株套袋成熟種子油份以及脂肪酸成分的測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因T0代植株油份分布出現(xiàn)類似正態(tài)分布的趨勢,與轉(zhuǎn)基因陰性對照相比,脂肪酸組分沒有明顯變化,而油份含量有所增高,最高增加了10.5個(gè)百分點(diǎn)。這些T0代植株出現(xiàn)類似正態(tài)分布的油份分布趨勢說明,目標(biāo)基因在不同轉(zhuǎn)基因油