胰蛋白酶抑制因子和蛻皮激素受體基因在煙草中的轉(zhuǎn)化.pdf

1、轉(zhuǎn)基因植物是防治害蟲的有效方法，胰蛋白酶調(diào)節(jié)抑制因子(Trypsin-modulating oostatic factor，TMOF)可以有效地抑制昆蟲中腸胰蛋白酶的活性，昆蟲蛻皮激素受體基因EcR和USP是調(diào)控發(fā)育的主要靶基因。本論文構(gòu)建了含TMOF和蛻皮激素受體的載體，轉(zhuǎn)化到煙草植株，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 為了研究TMOF同源物基因在轉(zhuǎn)基因植物廣譜抗蟲中的作用，我們利用人工合成的TMOF同源物基因，構(gòu)建了由組成型CaMV3

2、5S啟動子驅(qū)動的單價植物表達(dá)載體PCAMBIA1301-Aea-TMOF1、Aea-TMOF2、Neb-TMOF和雙價植物表達(dá)載體PCAMBIA1301-Aea-TMOF2+Neb-TMOF，并利用PCR方法鑒定，獲得陽性克隆。
　　 植物可以成功介導(dǎo)昆蟲的RNA干擾進(jìn)而引起昆蟲體內(nèi)特定基因的沉默，以棉鈴蟲蛻皮激素受體基因EcR和USP為靶標(biāo)，構(gòu)建了由組成型CaMV35S啟動子驅(qū)動的在植物體內(nèi)可表達(dá)棉鈴蟲EcR和USP雙鏈RNA

3、的載體PBI121+ds-EcR+ds-USP，并利用PCR方法鑒定獲得目的雙價載體。天然內(nèi)含子miRNA可以形成RNA干擾作用，在PCAMBIA1301+Aea-TMOF2載體的基礎(chǔ)上，插入含棉鈴蟲EcR基因的內(nèi)含子，構(gòu)建了雙價植物表達(dá)載體PCAMBIA1301+Aea-TMOF2+ds-EcR，并鑒定獲得目的載體。
　　 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化，采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株，然后通過葉盤法把上述6個構(gòu)建的