抗隱孢子蟲鼠基因型CP15-60蛋白單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)是一種嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康的人獸共患寄生原蟲，其暴發(fā)和流行逐年遞增，危害不容忽視。盡管嘗試了上千種藥物，至今尚無有效的治療藥物。因此，建立靈敏快捷的免疫學(xué)檢測技術(shù)，加強(qiáng)隱孢子蟲病的診斷和預(yù)防，已經(jīng)成為當(dāng)前隱孢子蟲病防治工作的重中之重。隨著生物技術(shù)的成熟和發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)特異性McAb在各種疾病的診斷和防治發(fā)揮了極其重要的作用，也可能為隱孢子蟲病的診斷和防治提供重要手段。
　　 為

2、獲得高特異性的抗隱孢子蟲單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)。本研究以原核表達(dá)的重組隱孢子蟲鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)子孢子表面抗原CP15/60為免疫原，免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，用間接ELISA方法進(jìn)行抗體效價(jià)測定，有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。以常規(guī)染色體分析法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的染色體分析；用McAb亞類鑒定試劑盒鑒定McAb亞型；間

3、接ELISA法測定相對親和力及交叉反應(yīng)性；Western blot檢測抗體的特異性。結(jié)果獲得了8株能穩(wěn)定分泌抗重組CP15/60(recombinant CP15/60，rCP15/60)的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A2E4、B6A5、C3H2、G2B7、D8H5、B4F7、E2G4和C6F7，其腹水抗體效價(jià)最高達(dá)到1∶1×107。對效價(jià)最高的B4F7、D8H52株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，結(jié)果染色體數(shù)目B4F7株為97±4條、D8H5

4、株為90±7條，且觀察到標(biāo)志染色體；抗體亞類均為IgG1，輕鏈均為κ鏈；相對親和力常數(shù)B4F7株為0.009μg/mL、D8H5株為0.016μg/mL；2株McAb均與rCP15/60蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)卵囊可溶性蛋白、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)裂殖子蛋白以及日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)蟲體蛋白均無交叉反應(yīng)，表明本試驗(yàn)獲得了2株高特異

5、性的抗隱孢子蟲McAb。
　　 選取相對親和力，效價(jià)較高的抗隱孢子蟲單克隆抗體B4F7株與兔多抗進(jìn)行雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)，最終建立了用于檢測隱孢子蟲卵囊的雙抗夾心ELISA，繪制標(biāo)準(zhǔn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為y=0.27x-0.01，其中x=log(卵囊數(shù)量)，該法最低檢測限為128個(gè)卵囊/mL，最適檢測范圍為128～6.3×107個(gè)卵囊/mL。通過交叉反應(yīng)、重復(fù)性檢測、雙盲試驗(yàn)及敏感性試驗(yàn)等，結(jié)果表明該雙抗體夾心