沙田柚花柱自交不親和相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、本研究以高度自交不親和的沙田柚（Citrus grandis var. Shatinyu Hort.）為試材，采用抑制性消減雜交技術(shù)，分別以沙田柚自交花柱cDNA為檢測(cè)子，異交花柱cDNA為驅(qū)動(dòng)子，構(gòu)建了自交花柱正向消減cDNA文庫，在沙田柚中克隆了與自交不親和相關(guān)基因的EST。并運(yùn)用菌液PCR技術(shù)、重組質(zhì)粒提取和酶切相結(jié)合的方法對(duì)文庫進(jìn)行了篩選，從中隨機(jī)挑取了部分陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)序列用NCBI-Blastx和Blastn在線軟件

2、分析，通過與Genbank中的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，我們找到了一些與沙田柚自交不親和相關(guān)的基因，為進(jìn)一步闡明沙田柚自交不親和的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 研究結(jié)果如下： 藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)表明，SSH文庫重組率高于95％，共有247個(gè)獨(dú)立克隆；PCR檢測(cè)和重組質(zhì)粒酶切結(jié)果表明，文庫共獲得128個(gè)陽性克隆，其插入片段的大小分布在0.1-1.0kb之間，主要集中在250-500bp之間；隨機(jī)挑取的120個(gè)陽性克隆的測(cè)序結(jié)果顯示，共

3、獲得30條獨(dú)立的ESTs，其中23條具有明確的功能比對(duì)結(jié)果，占總數(shù)的76.7％。 23條ESTs，通過Blastx搜索，找到兩類與自交不親和相關(guān)的基因：hect E3 泛素連接酶和蛋白激酶表達(dá)基因，前者可能通過泛素/26S蛋白酶體途徑介導(dǎo)沙田柚自交不親和反應(yīng)，后者可能通過蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化的細(xì)胞信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)沙田柚自交不親和反應(yīng)；還找到柱頭表達(dá)蛋白、質(zhì)膜H+ATPase、rRNA內(nèi)含子編碼核酸內(nèi)切酶以及膜關(guān)聯(lián)蛋白表達(dá)

4、基因，這些基因有可能為“膜受體”假說提供分子水平上的證據(jù)。 另7條ESTs，通過Blastn搜索，發(fā)現(xiàn)其中兩條與已報(bào)道的自交不親和相關(guān)基因在核酸水平上有較高的同源性，即編碼S1-Rnase、S9-Rnase的基因，相似度分別達(dá)到了88％和89％，這2條ESTs極有可能是決定沙田柚自交不親和的S-基因。還有兩條與泛素/26S蛋白酶體途經(jīng)相關(guān)的基因和一些與自交不親和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，以及與細(xì)胞凋亡、通道運(yùn)輸和分子伴侶相關(guān)的基因，它

5、們可能直接或間接參與沙田柚的自交不親和反應(yīng)。 為研究所獲得的差異表達(dá)基因具有的生物學(xué)功能，我們把由Blastx搜索到的蛋白質(zhì)信息按GO分類系統(tǒng)聚成了9類，根據(jù)所占比例的大小順序排列如下：催化活性、結(jié)合類功能、生理學(xué)途徑、細(xì)胞膜成分、分子伴侶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)節(jié)酶活性、離子運(yùn)輸以及細(xì)胞凋亡。這些信息表明沙田柚自交不親和反應(yīng)可能是一個(gè)復(fù)雜的多基因協(xié)同作用過程。 此外，還發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白、柑橘腐根病病毒抗性、動(dòng)力蛋白重鏈家族蛋白等與植物