金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達基因篩選與體內(nèi)定殖階段cDNA文庫構(gòu)建.pdf

1、重慶大學博士學位論文金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達基因篩選與體內(nèi)定殖階段cDNA文庫構(gòu)建姓名：張傳博申請學位級別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導(dǎo)教師：夏玉先20090612重慶大學博士學位論文菌體( h y p h a l b o d y ) 。2 ．根據(jù)寄主血細胞和病原真菌細胞結(jié)構(gòu)差別，建立和完善了利用蛋白酶K 和S D S 迅速裂解寄主血細胞的方法，整個流程時間約4 0 m i n ，R T - P C R 檢測表明，利用寄主血細胞裂

2、解釋放的內(nèi)源性R N a s e s 和后續(xù)P B S 洗滌可高效去除血淋巴分離綠僵菌菌體中的寄主核酸污染，這一結(jié)論也被后續(xù)E S T 序列分析所證明。3 ．以寄主體內(nèi)分離，去除寄主核酸污染的綠僵菌菌體提取m R N A 為實驗組( t e s t e r ) ，用R N A f r a g m e n t a t i o n b u f f e r 處理東亞飛蝗翅膀，降解寄主核酸，并誘導(dǎo)附著孢形成與分化，以該時期的菌體提取m R N

3、A 為驅(qū)動組( d r i v e r ) ，進行抑制消減雜交( s u p p r e s s i o n s u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o n , S S H ) ，篩選出3 5 0 個陽性克隆，測序，獲得的E S T 序列經(jīng)聚類分析、共拼接成1 2 0 u n i q u e E S T s ，其中1 0 0 條s i n g l e t o n s ，2 0 條e o n

4、t i g s ，經(jīng)基因注釋和功能分類，2 9 條( 2 4 ．1 7 ％) E S T s 和N R 數(shù)據(jù)庫有同源性，其功能參與各種細胞代謝和應(yīng)答過程，包括細胞代謝、蛋白代謝、細胞結(jié)構(gòu)與功能以及參與脅迫和抵抗等生物學過程。4 ．為驗證消減效率，隨機選擇5 個預(yù)測基因，以半定量R T - P C R 分析了在綠僵菌侵染東亞飛蝗不同階段的表達水平，包括碗豆素脫甲基酶( p i s a t i n d e m e t h y l a s e

5、 )基因( M p d l ) ，?！┐蓟? 儀．e n o l a s e ) 基因( M e l ) ，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶( p r e n y lt r a n s f e r a s e ) 基因( M p t ) ，a ．1 ，2 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶( a ．1 ，2 ．m a n n o s y l t r a n s f e r a s e ) 基因( M m n t l ) ，膽堿脫氫酶( c h o l i nd e h

6、 y d r o g e n a s e ) 基因( M c d ) 。結(jié)果表明5 個基因均在定殖寄主血淋巴階段有較高的表達量。5 ．為篩選附著孢形成階段特異表達或上調(diào)表達基因，以無寄主核酸污染的蝗蟲翅膀誘導(dǎo)附著孢形成，提取m R N A 為實驗組( t e s t e r ) ，以去除寄主核酸污染的血淋巴分離綠僵菌菌體提取m R N A 為驅(qū)動組( d r i v e r ) ，消減雜交篩選出4 6 0 個陽性克隆，測序，獲得3 2

7、9 條高質(zhì)量E S T s ，聚類分析、拼接成7 8 u n i q u eE S T s 。其中4 6 條E S T s 與數(shù)據(jù)庫中己知蛋白序列有明顯的同源性，2 4 條己知功能的同源E S T s涉及多種代謝和應(yīng)答過程，包括細胞代謝、蛋白代謝、細胞結(jié)構(gòu)與功能以及脅迫和抵抗等生物學過程。6 ．隨機選擇1 2 條E S T s ，分別提取綠僵菌在蝗蟲翅膀生長8h 、1 5h 、2 4 h 、3 0 h ，以及體內(nèi)定殖階段( 第2 天、第

8、3 天、第4 天、第5 天、第6 天、第7 天)血淋巴的總R N A ，D N a s e I 處理后，以3 ．磷酸甘油醛脫氫酶基因( G 3 p d h ) 為參照基因，進行半定量分析，結(jié)果表明1 2 條E S T s 均在附著孢形成時期上調(diào)表達。7 ．D S N 均一化和S M A R T 技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了金龜子綠僵菌C Q M a l 0 2 定殖東亞飛蝗血淋巴階段的全長均一化c D N A 文庫，并對整個文庫進行了E S T 序