減毒沙門氏菌作為雞新城疫口服DNA疫苗載體的基因免疫研究.pdf

1、該研究應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增了新城疫病毒強(qiáng)毒株F<,48>E<,9>株融合蛋白(F)基因,并將其插入到pcDNA3的CMV啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-F.序列測(cè)定結(jié)果表明,克隆的F基因全長(zhǎng)1668bp,編碼553個(gè)氨基酸.序列分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,F<,48>E<,9>株F蛋白含有3個(gè)分別由25個(gè)氨基酸組成的疏水區(qū),存在6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),13個(gè)半胱氨酸殘基,裂解位點(diǎn)區(qū)域的氨基酸序列為RRQRRF,說(shuō)明民F<,48>E

2、<,9>株是一株典型的強(qiáng)毒株.氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn),F<,48>E<,9>與雞源NDV毒株的同源性在91.3﹪-95.5﹪,其中與Australia-victoria株同源性高達(dá)95.5﹪,而與鴿源的Ch/98-1株和鵝源的ZJ1株的同源性相對(duì)較低(90.6 ﹪).將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-F高壓電轉(zhuǎn)化dam和phoP基因雙突變的減毒鼠傷寒沙門氏菌ZJ111株(ZJ111/pcDAN3-F),并直接轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,分別提取細(xì)胞總

3、DNA和總RNA, DIG標(biāo)記探針均可檢測(cè)到陽(yáng)性雜交信號(hào).FITC標(biāo)記的羊抗雞IgG進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)可檢測(cè)到特異性的黃綠色熒光.ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后48hF蛋白開始表達(dá),隨后逐漸增多.SDS-PAGE和免疫印跡可檢測(cè)到55kD的蛋白條帶.上述試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)減毒沙門氏菌不僅可將目的基因呈遞給Vero細(xì)胞,而且還得到了轉(zhuǎn)錄和表達(dá),表達(dá)的F蛋白具有免疫反應(yīng)性.小鼠安全性試驗(yàn)表明,ZJ111/pcDNA3-F菌株只有在10<'9>c

4、fu高劑量口服后引起個(gè)別小鼠的死亡,其它各口服劑量組菌沒(méi)有出現(xiàn)死亡.將ZJ111/pcDAN3-F以10<'8>cfu的口服劑量口服接種3日齡非免疫來(lái)航雞,未見任何不良反應(yīng),也不影響雞只的增重,脾臟、肝臟等主要器官的沙門氏菌在二次免疫后2周已被雞體的免疫系統(tǒng)所清除,表明利用ZJ111作為載體傳遞DNA疫苗具具有相對(duì)安全性.用酶切和PCR鑒定法證實(shí)在體內(nèi)外無(wú)抗生素存在的條件下重組質(zhì)粒在受體菌ZJ111菌株內(nèi)比較穩(wěn)定,表明ZJ111為載體傳

5、遞DNA疫苗具有良好的穩(wěn)定性.該研究結(jié)果表明:以減毒沙門氏菌為載體傳遞NDVF基因的口服DNA疫苗能誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生抗NDV的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并具有較好的免疫保護(hù)效果.DNA疫苗口服免疫具有省時(shí)、方便、價(jià)廉、易于群體免疫等優(yōu)點(diǎn),有望代替肌肉注射或基因槍等DNA疫苗的免疫方式,是研制低成本、實(shí)用化口服禽類DNA疫苗的一條新途徑.如何提高NDVDNA疫苗的免疫效果,探明目的基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和抗原遞呈機(jī)理以及減毒沙門氏菌的生物安全性