減毒雞傷寒沙門氏菌△asd缺失株的構建及其攜帶外源基因的表達.pdf

1、沙門氏菌是一種非常重要的人獸共患病病原菌，主要引起人和動物的發(fā)熱、腸炎、敗血癥等多種疾病癥狀，呈全球性分布。沙門氏菌為胞內侵襲性細菌，能有效呈遞抗原，激發(fā)抗沙門氏菌和誘導外源蛋白的特異性體液免疫與細胞免疫，并能同時誘導黏膜免疫與全身免疫。近幾年，沙門氏菌常通過宿主載體平衡致死系統(tǒng)構建新型疫苗載體。 減毒雞傷寒沙門氏菌疫苗株97A是經(jīng)轉座突變及粗糙變異篩選所獲得，本實驗室已從安全性、免疫效力和病理組織學等各個方面對97A疫苗株作出

2、評價，研究結果表明，該減毒株具有較好的安全性和免疫效力。本研究旨在研制更加安全的減毒雞傷寒沙門氏菌97A疫苗株，并將其開發(fā)為新型活疫苗載體。以97A為親本菌，缺失基因組中編碼天冬氨酸-β-半乳糖脫氫酶的asd基因，構建asd宿主載體平衡致死系統(tǒng)，用于高效表達外源基因，初步應用該系統(tǒng)表達了紅色熒光蛋白基因和新城疫F蛋白基因部分片段，為研制新型載體疫苗奠定了基礎。 1.減毒雞傷寒沙門氏菌97A△asd缺失株的構建與鑒定 為了

3、研制更加安全的雞傷寒沙門氏菌弱毒株，并使其開發(fā)為活疫苗載體，本研究構建了雞傷寒沙門氏菌97A△asd缺失株，并以此建成宿主載體平衡致死系統(tǒng)。根據(jù)雞傷寒沙門氏菌asd基因已發(fā)表的基因序列，設計并合成了2對引物，PCR方法擴增了asd上下游序列。通過氯霉素抗性基因替代asd基因中間片段，構建重組自殺性質粒，與雞傷寒沙門氏菌野生菌接合轉移，兩步法篩選△asd缺失株。結果表明，△asd缺失株被成功構建，命名為97A△asd缺失株，其表型、生長特

4、性及生化特征與野生菌保持一致?；蚧パa試驗結果顯示，該突變株能穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白，即該宿主載體平衡致死系統(tǒng)能高效表達外源基因，為雞傷寒沙門氏菌載體疫苗的進一步研究奠定了基礎。 2.新城疫病毒F基因部分片段在減毒雞傷寒沙門氏菌97A△asd缺失株中的表達 以重組質粒pVAXl-F為模板擴增594 bp的NDV-F基因部分片段，亞克隆至原核表達質粒pYA3334中，獲得X6212(pYA3334-F)。從大腸桿菌X6212

5、提取重組質粒pYA3334-F，并將其電轉化沙門氏菌中間宿主X3730進行甲基化處理，最后將甲基化的原核表達質粒pYA3334-F電轉化X4550，SDS-PAGE電泳和免疫試驗檢測到F表達。將驗證正確的重組質粒pYA3334-F電轉化97A△asd缺失株，SDS-PAGE電泳檢測F表達。攜帶F的重組菌97A(pYA3334-F)及對照菌97A(pYA3334)以1△109 CFU/只肌注免疫雛雞，結果表明該重組菌是安全的，免疫組產(chǎn)生了