蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry1Ie定向進(jìn)化的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲(chóng)微生物，其殺蟲(chóng)活性主要來(lái)源于殺蟲(chóng)基因編碼的晶體蛋白。但是，Cry蛋白殺蟲(chóng)譜窄、毒力有限，以及害蟲(chóng)對(duì)Bt毒素的抗性風(fēng)險(xiǎn)上升等諸多弱點(diǎn)和因素將嚴(yán)重制約Bt在未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)一步發(fā)揮巨大作用。但是，繼續(xù)從自然界中分離克隆得到對(duì)害蟲(chóng)具有高毒力的新型Btcry基因難度不斷增加。因此，通過(guò)分子設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)工程等新的技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的Cry毒素進(jìn)行改造、使之發(fā)揮

2、更大的作用是不少研發(fā)單位的新的研究目標(biāo)。
　　 本論文圍繞建立一種可控突變率的隨機(jī)突變文庫(kù)的方法、蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白Crylle的定向進(jìn)化等方面進(jìn)行了一系列的研究，主要結(jié)果如下：
　　 1、將crylAc基因啟動(dòng)子與crylIe基因通過(guò)重疊引物PCR的方法連接在一起，構(gòu)建crylIe基因在E.coliJM109中的表達(dá)載體。
　　 2、在建立隨機(jī)突變文庫(kù)的過(guò)程中，依據(jù)TaqDNA聚合酶在合成堿基時(shí)的固有誤

3、差和突變特性，結(jié)合Cry毒素定向進(jìn)化過(guò)程中需要的堿基突變數(shù)目，計(jì)算得到產(chǎn)生預(yù)期堿基突變所需PCR循環(huán)數(shù)。同時(shí)，本研究采用了熒光定量PCR監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中DNA擴(kuò)增來(lái)控制TzqDNA聚合酶的聚合反應(yīng)的次數(shù)。
　　 3、以對(duì)小菜蛾（Plutellaxylostella）、亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）有殺蟲(chóng)活性的crylIe基因?yàn)椴牧希?個(gè)不同堿基替換率的隨機(jī)突變文庫(kù)，文庫(kù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的每個(gè)DNA分子的預(yù)期堿

4、基替換個(gè)數(shù)分別為1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)。從3個(gè)文庫(kù)中分別隨機(jī)挑取100個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定分析，結(jié)果表明，突變的堿基位點(diǎn)在crylIe基因中隨機(jī)均勻分布；文庫(kù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ突變的單克隆數(shù)分別為59個(gè)、93個(gè)和98個(gè)；無(wú)義突變的克隆數(shù)分別為36個(gè)、43個(gè)、50個(gè)，錯(cuò)義突變的克隆數(shù)分別為13個(gè)、41個(gè)、38個(gè)；平均堿基替換個(gè)數(shù)為0.86個(gè)、2.1個(gè)、2.79個(gè)。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究設(shè)計(jì)的方法可以很好控制突變文庫(kù)的堿基突變率，預(yù)期突變2個(gè)堿基的文庫(kù)最

5、適合用作Cry毒素的定向進(jìn)化。
　　 4、建立隨機(jī)突變文庫(kù)之后，進(jìn)一步用小菜蛾進(jìn)行生物活性的測(cè)定。測(cè)試了92個(gè)錯(cuò)義突變的突變株，結(jié)果表明與未突變的CrylIe（LC50為1.96μg/ml）相比活性升高的有11株，其LC50分別是0.20、0.82、0.15、0.44、0.62、0.50、0.29、0.51、0.58、0.30、0.67μg/ml，氨基酸的變化分別是Y162H&E181K、N214S、V236A、K237R、Y2

6、39H&A307V、N258Y、1285T&R506G、P320H&Y599N、Y422H、1507V、A522V，這些突變位點(diǎn)分別分布在CrylIe的三個(gè)結(jié)構(gòu)域中，其中活性提高最明顯是13倍，位于結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的雙突變體Y239H&A307V。
　　 本研究建立了一種簡(jiǎn)單的可控突變率的隨機(jī)突變文庫(kù)的方法；在此基礎(chǔ)上，篩選獲得了多個(gè)毒力提高的突變，結(jié)果說(shuō)明本文所建立的定向進(jìn)化方法適合于其它Cry，毒素，研究所獲得的各種突變體，將為抗