大豆疫霉轉(zhuǎn)錄組研究及GPR功能分析.pdf

1、大豆疫霉（phytophthora sojae）侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，每年造成大豆20多億美元的經(jīng)濟(jì)損失。大豆疫霉在田間的傳播主要通過形成孢子囊，釋放游動(dòng)孢子，在水膜存在的條件下，通過識(shí)別植株分泌的異黃酮等化學(xué)信號(hào)分子，定向游動(dòng)，尋找寄主植物，最終成功侵染感病植物。
　　 大豆疫霉不同階段RNA-Seq分析。RNA-Seq是一種快速而高效地分析組織或細(xì)胞基因表達(dá)的方法，它不僅能夠全面地分析特定組織

2、或細(xì)胞表達(dá)的基因并得到這些基因表達(dá)豐度的數(shù)量信息，而且還可以比較不同組織、不同時(shí)空條件下基因的表達(dá)差異。通過對(duì)大豆疫霉（Phytophthora sojae）無性階段和大豆疫霉與寄主植物大豆互作時(shí)期的RNA進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分標(biāo)簽都可以map到大豆疫霉基因組，只有8％-15％的標(biāo)簽在已知的大豆疫霉基因模型上找不到對(duì)應(yīng)的基因，這些標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的基因可能是新基因。通過對(duì)不同階段的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：形態(tài)相近階段的相關(guān)

3、性最高，形態(tài)相差較遠(yuǎn)的兩個(gè)階段的相關(guān)性比較低。通過對(duì)已經(jīng)map到大豆疫霉基因模型上的基因進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在游動(dòng)孢子階段上調(diào)表達(dá)的基因有1812個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有4683個(gè)。通過對(duì)大豆疫霉中已經(jīng)預(yù)測的G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體在游動(dòng)孢子階段上調(diào)表達(dá)，15個(gè)在游動(dòng)孢子階段下調(diào)表達(dá)。RNA-Seq分析為大豆疫霉功能基因組研究提供了豐富的轉(zhuǎn)錄組信息。
　　 大豆疫霉PsGPR7的功能分析。G蛋白

4、偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）是跨膜受體中最大的一類，負(fù)責(zé)將胞外信號(hào)刺激傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起復(fù)雜的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。根據(jù)大豆疫霉RNA-Seq結(jié)果，選取一個(gè)在游動(dòng)孢子階段顯著上調(diào)表達(dá)的GPCR，命名為PsGPR7（ID：158209）。PsGPR7含有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域，在大豆疫霉基因組中是單拷貝的。利用PEG-CaCl2介導(dǎo)的大豆疫霉遺傳轉(zhuǎn)化沉默PsGPR7得到3個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子。表型分析發(fā)現(xiàn)：Ps

5、GPR7沉默突變體休止孢的萌發(fā)率與野生型相比下降40％左右，而且突變體游動(dòng)孢子對(duì)大豆葉片的致病性顯著下降。PsGPR7的沉默不影響菌絲的生長速率、孢子囊的產(chǎn)生、游動(dòng)孢子的釋放以及卵孢子的產(chǎn)量，并且突變體游動(dòng)孢子對(duì)谷氨酸、異黃酮及根部分泌物的趨化性和對(duì)照菌株P(guān)6497無差異。結(jié)果表明：PsGPR7對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子的萌發(fā)和致病性有重要作用.
　　 大豆疫霉PsGPR8的功能分析。根據(jù)大豆疫霉菌株P(guān)6497 RNA-Seq結(jié)果和GP

6、CR的全基因分析數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)選取一個(gè)在游動(dòng)孢子階段下調(diào)表達(dá)GPCR，命名為PsGPR8（ID：134277）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域。利用大豆疫霉CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，得到2個(gè)沉默突變體。PsGPR8突變體菌絲生長速率、孢子囊產(chǎn)量、游動(dòng)孢子釋放、休止孢萌發(fā)、卵孢子產(chǎn)量和對(duì)合豐35的致病性與對(duì)照P6497無差異。此外，突變體游動(dòng)孢子對(duì)谷氨酸、異黃酮及根部分泌物的趨化性和對(duì)照P6497無差異。結(jié)果表