利用體細胞核移植技術生產轉基因山羊的研究.pdf

1、動物轉基因是目前生物領域的研究熱點之一,其基本特征是改變了動物的遺傳組成,使動物按照人們的意愿進行改造.以傳統(tǒng)的原核顯微注射法生產轉基因動物的效率非常低下(成功率僅為3~5﹪),嚴重地制約了轉基因動物研究進展.與之相比,體細胞克隆技術在生產轉基因動物方面有著不可比擬的優(yōu)越性.利用體細胞克隆技術生產轉基因動物的優(yōu)點是:轉基因操作主要是集中在細胞水平上完成,從而極大地提高了生產效率、降低了生產成本和減少了工作強度;在體外可以監(jiān)控轉基因的表達

2、水平,以便獲得高效表達轉基因動物;對基因進行定點修飾,促進生物醫(yī)藥、功能基因組等方面的研究.該實驗以Myostatin基因為靶基因、含有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、胸苷激酶、LoxP位點的雙標記選擇載體作為框架結構、羊胎兒成纖維細胞和成年耳部成纖維細胞系為轉染細胞,測定了不同轉染方法(磷酸鈣法,脂質體法及電擊法)的轉染效果,篩選陽性細胞克隆,借助體細胞克隆技術生產轉基因克隆胚胎.建立了一套完整的轉基因結構制備、體細胞的傳代培養(yǎng)、體

3、細胞性別鑒定、轉基因、轉基因細胞系建立、轉基因克隆胚胎的生產等操作程序,為羊轉基因體細胞克隆提供了行之有效的實驗方法.通過實驗證明,構建的ploxP-M雙標記同源重組轉基因載體可以很好地實現基因敲除目的.磷酸鈣法、:脂質體法及電擊法可有效地轉染山羊胎兒成纖維細胞,但以電擊法效果為最佳,該轉染方法還具有適合于不同片段大小、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點.在隨機整合細胞系中由于插入位點和轉基因拷貝數的不同造成了熒光蛋白表達水平的差異,但更重要的是