參與初情期啟動(dòng)的山羊卵巢miRNA篩選與鑒定.pdf

1、初情期是動(dòng)物首次發(fā)情并排卵的時(shí)期，是動(dòng)物開(kāi)始獲得繁殖力的一種標(biāo)志，闡明初情期啟動(dòng)機(jī)制對(duì)于畜牧學(xué)和醫(yī)學(xué)均具有重大意義。MicroRNAs（miRNA）是普遍存在于真核生物中的非編碼RNA，可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致其降解或抑制其翻譯。有證據(jù)顯示 miRNA參與了動(dòng)物初情期的調(diào)節(jié)。為揭示miRNA介導(dǎo)在山羊初情期啟動(dòng)的機(jī)制，本研究采用公羊試情、外陰檢查，并結(jié)合卵巢組織學(xué)觀察的方法選取初情期前和初情期雌性黃淮山羊各3只

2、，采用新一代高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)其卵巢miRNA進(jìn)行了測(cè)序和比較，篩選出了可能參與調(diào)控初情期啟動(dòng)的miRNA，并對(duì)候選靶基因進(jìn)行了GO（Gene Ontogy）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genoms）通路分析，試驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）從卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)看出，初情期前和初情期卵巢皮質(zhì)上均有不同發(fā)育時(shí)期的卵泡，但無(wú)黃體；而初情期卵巢皮質(zhì)中卵泡較大，卵泡內(nèi)充滿大量的顆

3、粒細(xì)胞。
　?。?）6個(gè)小RNA（small RNA,sRNA）文庫(kù)高通量測(cè)序后，原始序列（raw reads）經(jīng)去接頭、去污染和去低質(zhì)量等凈化過(guò)程后，初情期3個(gè)樣P_1、P_2和P_3文庫(kù)中得到的純凈序列（clean reads）分別為13773420、15120274和12113416，占rawreads比例分別為98.17％、98.05%和98.07%；初情期前3個(gè)樣Pb1、Pb2和Pb3文庫(kù)中得到的clean reads分

4、別為10101765、11611140和11276907，占rawreads比例分別為98.64%、97.42%和96.98%。
　　（3）篩選的sRNA長(zhǎng)度主要集中在20~24 nt，以22 nt長(zhǎng)度達(dá)到最大，在初情期3個(gè)文庫(kù)中分別占到49.87%、51.65%和49.73%；初情期前3個(gè)文庫(kù)中分別占到48.78%、48.39%和50.58%。
　?。?）與miRbase20.0數(shù)據(jù)庫(kù)比較，根據(jù)miRNA的成熟體及前體結(jié)果

5、，初情期和初情期前共篩選出已知保守的miRNA409個(gè)，預(yù)測(cè)的miRNA117個(gè)；差異表達(dá)的miRNA共489個(gè)，其中在初情期特異表達(dá)的miRNA有21個(gè)，在初情期前特異表達(dá)的miRNA有20個(gè)，在初情期與初情期前共表達(dá)的miRNA有448個(gè)。
　?。?）初情期與初情期前表達(dá)顯著差異的miRNA共篩選出30個(gè)，其中初情期較初情期前表達(dá)差異上調(diào)的miRNA有9個(gè)，表達(dá)差異下調(diào)的miRNA有21個(gè)。
　?。?）對(duì)潛在調(diào)控初情期啟

6、動(dòng)的miRNA靶基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，miRNA靶基因參與了細(xì)胞代謝過(guò)程（cellular process）、膜（membrane）和結(jié)合（binding）等多種生物學(xué)過(guò)程；進(jìn)行KEGG相關(guān)通路分析，結(jié)果 KEGG相關(guān)通路分析表明 miRNA靶基因參與多種信號(hào)通路，主要富集在嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Olfactory transduction），其中GABA神經(jīng)遞質(zhì)的突觸傳導(dǎo)（GABAergic synapse）、催產(chǎn)素信號(hào)通路（Oxytoc

7、in signaling pathway）、促性腺激素釋放激素信號(hào)通路（GnRH signaling pathway）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、cAMP信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟（Progesterone-mediated oocyte maturation）與減數(shù)分裂（Oocyte meiosis）等多個(gè)通路都可能與初情期啟動(dòng)相關(guān)。<

8、br>　?。?）從差異表達(dá)的30個(gè)miRNA中隨機(jī)選擇7個(gè)（chi-miR-182、chi-miR-655、chi-miR-3955-5p、chi-miR-376c-3p、chi-miR-376e-3p、chi-miR-136-3p和chi-miR-423-5p），應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)驗(yàn)證本次試驗(yàn)高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性，結(jié)果顯示miRNA的表達(dá)水平和測(cè)序結(jié)果一致。
　　結(jié)論：本次高通量測(cè)序共篩選了初情期與初情期前的489個(gè)