表達(dá)傳染性法氏囊病病毒VP2重組乳酸菌主動(dòng)遞送活載體的構(gòu)建及免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類代謝性能、生理特征及形態(tài)上不完全相同的革蘭氏陽(yáng)性菌，其主要的特征是通過(guò)發(fā)酵碳水化合物代謝產(chǎn)生乳酸，大多數(shù)種屬對(duì)動(dòng)物或植物具有益生特性。早期被人們廣泛的應(yīng)用于食品發(fā)酵并取得了巨大的成功。隨著對(duì)于益生乳酸菌的生理特性和分子遺傳特性研究的深入，研究者們逐漸認(rèn)識(shí)到乳酸菌可以作為遞送異源抗原的活載體，對(duì)于各種疾病的預(yù)防與治療具有巨大的應(yīng)用前景。特別是重組乳酸菌作為活載體疫苗不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)

2、生系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，而且可以同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體的黏膜免疫應(yīng)答。重組乳酸菌活載體沒(méi)有致病性，并且應(yīng)用于動(dòng)物與人類，但是其遞呈抗原蛋白存在著表達(dá)和遞送效率的嚴(yán)重不足，不能引起機(jī)體足夠的免疫應(yīng)答等問(wèn)題。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建乳酸菌主動(dòng)遞送系統(tǒng)，從而提高抗原的遞送效率，激活機(jī)體免疫應(yīng)答效率，為研究新型乳酸菌活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　本研究利用完全食品級(jí)基因工程菌株乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ3900及其配套的表達(dá)載體pNZ81

3、49，在引入“內(nèi)化蛋白”的同時(shí)，融合表達(dá)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要抗原蛋白VP2蛋白。首先引入了PagN蛋白（介導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica serovarTyphimurium)粘膜侵入上皮細(xì)胞的膜外蛋白，作為內(nèi)化蛋白），構(gòu)建了r-L.Lactis-VP2-PagN和r-L.Lactis-PagN-VP2兩株重組乳酸乳球菌;其次，引入了Omp蛋白（僅有20個(gè)氨基酸的Omp短肽，可與M細(xì)胞C5a受體

4、結(jié)合介導(dǎo)抗原的遞呈），構(gòu)建了r-L.Lactis-VP2-Omp。
　　體外檢測(cè)結(jié)果表明:經(jīng)過(guò)Western Blot驗(yàn)證表明，僅有r-L.Lactis-VP2-PagN成功表達(dá)融合蛋白，蛋白大小為73 kDa與預(yù)期結(jié)果一致，并且融合蛋白保持穩(wěn)定，具有黏附上皮細(xì)胞系HT-29的能力;r-L.Lactis-VP2-Omp經(jīng)Western Blot驗(yàn)證融合蛋白大小約為49.46 kDa，和預(yù)期大小一致，融合蛋白的表達(dá)含量達(dá)到53.17

5、μg/mL，常溫下重組乳酸乳球菌融合蛋白保持穩(wěn)定存在。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:r-L.Lactis-VP2-PagN設(shè)計(jì)了2個(gè)實(shí)驗(yàn)組（口服免疫組、注射免疫組），每組免疫劑量1×109 CFU/羽，2個(gè)對(duì)照組（空白菌株對(duì)照組、PBS對(duì)照組），7日齡和14日齡免疫，28日齡攻毒（1000 ELD50/羽），結(jié)果顯示:口服免疫組和注射免疫組血清抗體均為陰性;相比于對(duì)照組，口服免疫組口咽部位黏膜sIgA抗體滴度差異性不顯著，腸道黏膜sIg

6、A抗體滴度上升，差異性顯著(P＜0.05);口服免疫組和注射免疫組全部死亡，攻毒保護(hù)率均為0。表明r-L.Lactis-VP2-PagN未能有效的引起機(jī)體特異性的免疫應(yīng)答，不能抵抗IBDV超強(qiáng)毒株HLJ0504的攻擊。
　　r-L.Lactis-VP2-Omp的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為4組:口服免疫組、注射免疫組、不免疫攻毒組、不免疫不攻毒組;將r-L.Lactis-VP2-Omp的裂解液分別在14和21日齡進(jìn)行兩次SPF雞免疫接種，28日

7、齡進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn);實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)注射免疫實(shí)驗(yàn)組攻毒保護(hù)率可達(dá)到100％，口服免疫實(shí)驗(yàn)組攻毒保護(hù)率可達(dá)到60％;(2)口服免疫組和注射免疫組的血清ELISA抗體為陰性，但產(chǎn)生了較高的血清中和抗體;(3)口服免疫組在首次免疫一周后和二次免疫一周后腸道黏膜sIgA抗體滴度相比于不免疫對(duì)照組明顯升高，并且均差異性顯著（P＜0.05）;(4)口服免疫組存活雞100％的法氏囊有不同程度的損傷，注射免疫組存活雞80％法氏囊出現(xiàn)不同程度的損傷。以上