茶樹葉片中硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄與表達水平的研究.pdf

1、硒是人體最重要的微量元素。硒在人體內(nèi)最主要的生理功能是抗氧化作用；硒還可以改善免疫功能，提高抵抗力。美國醫(yī)學家稱硒是至今發(fā)現(xiàn)最強烈也最具潛力的抗癌營養(yǎng)素。據(jù)地質(zhì)學家考證：我國72％的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)。為提高硒營養(yǎng)水平，有專家推薦，應以增加膳食硒為主。茶葉是我國最受歡迎的飲品，而且茶葉中的硒含量比一般食品要高，可以通過富硒茶的形式補充人體的硒營養(yǎng)。硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Selenocysteine methyltransferase，SM

2、T）是植物體內(nèi)硒代謝途徑中的一個關鍵酶。已經(jīng)有學者通過在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中高表達黃芪（Astragalus bisulcatus）的SMT基因從而獲得了高積累硒的擬南芥植株。而關于茶樹硒代謝方面的研究比較少。目前生產(chǎn)富硒茶的方式主要是在富硒土壤上種植茶樹。能否通過改變SMT的轉(zhuǎn)錄與表達水平從而進一步提高富硒地區(qū)茶樹硒的含量，使低硒地區(qū)的茶樹可以生產(chǎn)富硒茶，仍舊是一個疑問。本實驗就是研究在富硒與非富硒環(huán)境

3、下生長的同一品種茶樹--祁門櫧葉種（Camellia sinensis Qimen-chuyezhong）的硒含量與SMT之間的關系，從而了解能否通過轉(zhuǎn)基因方法從根本上解決茶樹富硒的問題，也可以此為參考，研究非高積累硒植物的硒代謝途徑。
　　 本文以CTAB-LiCl法提取龍井43（C. sinensis cv Longjing43）葉片總RNA，根據(jù)茶樹α-微管蛋白（α-tubulin）的mRNA全長序列（GenBank登錄號

4、DQ340766）設計全長引物進行RT-PCR擴增，獲得α-tubulin cDNA全長片段，并連接至pET-32a（+）載體，在大腸桿菌BL21trx B（DE3）菌株中得到大量表達。SMT原核表達菌株的構建由本實驗室朱林完成。
　　 這兩個表達菌經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導，獲得大量融合蛋白，經(jīng)純化后進行SDS-PAGE，以切膠的方式制備抗原，免疫家兔獲得抗血清，經(jīng)特異性吸附純化后獲得了特異性抗體。以采自安

5、徽石臺富硒土壤和非富硒土壤的祁門櫧葉種嫩葉和老葉為實驗材料制備粗蛋白提取液，經(jīng)過SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，用制備的兩種抗體對其進行Western blot，檢測SMT在不同的樣品中的表達情況。
　　 同時，以同樣的方法提取富硒茶與非富硒茶老葉與嫩葉的總RNA。以M-MLV進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。分別設計SMT和3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH）

6、的特異性引物，并摸索各引物最適合的PCR條件以及各基因的平臺期。以上述四個樣品的cDNA第一鏈為模板進行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用軟件分析各條帶的灰度值，研究SMT在不同樣品中的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 本實驗成功構建了茶樹α-tubulin的原核表達載體，并且制備獲得了茶樹α-tubulin和SMT的特異性抗體。經(jīng)過Western blot實驗和半定量PCR實驗，發(fā)現(xiàn)在同一生長階段，SMT基因在富硒茶葉和非富硒茶葉中的轉(zhuǎn)錄和表達水平