益生芽孢桿菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究.pdf

1、本研究從健康土雞腸道中分離到67株芽孢桿菌，通過對(duì)抗逆性、產(chǎn)酶、抗菌活性等性能進(jìn)行檢測(cè)，篩選到兩株具有潛在益生效果的芽孢桿菌LBS53和LBS8。LBS53和LBS8對(duì)模擬胃腸道環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性，且可以耐受飼料中的高銅環(huán)境。其中LBS53對(duì)致病菌具有較強(qiáng)抑菌特性，可以產(chǎn)蛋白酶，淀粉酶和纖維素酶，酶系較全；LBS8無(wú)明顯抑菌特性，但有較高的產(chǎn)蛋白酶能力。這兩株菌基本具備作為飼用芽孢桿菌制劑菌株的條件。尤其LBS53的優(yōu)良生物學(xué)特性使其

2、在飼料工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。 通過生理生化試驗(yàn)和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明菌株LBS53和LBS8分別為枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。 對(duì)LBS53和LBS8進(jìn)行提高菌體生物量的液體發(fā)酵工藝與條件的研究，最終確定LBS53液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉2％，黃豆粉4％，K2HPO4：KH2PO4為0.1％：0.075％，MgSO4·7H2O0.025％，MnSO40.001 mmol/L，NaCl0.6％；

3、發(fā)酵條件為：溫度40℃，pH7.5，搖瓶裝量30 mL/250 mL，接種量5％，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，時(shí)間24 h。優(yōu)化后總菌體濃度達(dá)8.5×109 CFU·mL-1。LBS8液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：糖蜜2％，黃豆粉5％，K2HPO40.2％，KH2PO40.075％，MgSO4·7H2O0.025％，NaCl0.6％；發(fā)酵條件為：溫度40℃，pH7.5，搖瓶裝量30mL/250mL，接種量5％，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，時(shí)間2

4、4h。優(yōu)化后總菌體濃度達(dá)3.3×109 CFU·mL-1?？股貫E用已對(duì)禽畜業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅，對(duì)動(dòng)物和人類的健康造成了極大的危害。所以人們需要尋找和開發(fā)無(wú)毒、無(wú)副作用的天然生長(zhǎng)促進(jìn)劑，于是益生菌飼料添加劑應(yīng)運(yùn)而生。飼用微生物是一種新型飼料添加劑。它可以平衡動(dòng)物的腸道菌群，提高飼料的利用率，提高生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫力，從而推動(dòng)動(dòng)物健康快速生長(zhǎng)。作為益生菌的一種，芽孢桿菌因其獨(dú)特的生物特性成為研究熱點(diǎn)。芽孢桿菌為好氧或兼性厭氧，可產(chǎn)生

5、內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌。因?yàn)檠挎弑谥小捌べ|(zhì)層”的存在，芽孢對(duì)熱、紫外線及抗菌素具有很高的抗性，可以耐受飼料加工、儲(chǔ)藏和胃酸性環(huán)境。芽孢桿菌還具有分泌多種酶和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，有助于降解動(dòng)植物來(lái)源的大分子物質(zhì)，并為動(dòng)物提供維生素營(yíng)養(yǎng)。芽孢桿菌還可分泌活性抗菌物質(zhì)，提高機(jī)體防御能力?，F(xiàn)在許多國(guó)家如歐洲，美國(guó)，日本等，已大量使用芽孢桿菌飼料添加劑，并取得了豐碩的成果。我國(guó)對(duì)芽孢桿菌微生態(tài)制劑的研究相對(duì)較晚，絕大多數(shù)仍然存在一些問題，處于試驗(yàn)研究

6、階段。比如使用的芽孢桿菌多數(shù)是外籍菌。目前系統(tǒng)地研究益生菌的生理生化特性方面的研究還很少，而這些研究是降低成本提高產(chǎn)率，促進(jìn)動(dòng)物微生態(tài)制劑商品化的基礎(chǔ)。本研究的創(chuàng)新之處在于從禽畜腸道獲得天然菌種，篩選出性能穩(wěn)定、益生作用強(qiáng)和安全無(wú)副作用的菌種供生產(chǎn)應(yīng)用。 本研究通過從健康土雞腸道分離原籍芽孢桿菌，篩選出兩株益生性能較好的芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。并對(duì)最佳培養(yǎng)工藝進(jìn)行了研究。目的在于生產(chǎn)出天然、促生長(zhǎng)、預(yù)防疾病的芽孢桿菌飼

7、料添加劑，并為以后的研究及益生素的研制提供理論依據(jù)。 一 益生芽孢桿菌的篩選 經(jīng)高溫處理法從健康土雞腸道分離67株原籍芽孢桿菌，并對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色，挑選G+、產(chǎn)芽孢的菌株。 在初篩耐酸耐膽鹽試驗(yàn)中，通過梯度培養(yǎng)，逐漸增加培養(yǎng)基的酸度及膽鹽濃度，選出9株具有耐酸和耐膽汁特性的菌株。在復(fù)篩耐酸耐膽鹽試驗(yàn)中，通過對(duì)菌株在人工胃液和人工腸液中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析，挑選出6株具有耐受性的芽孢桿菌菌株。一般高銅在

8、飼料中的添加量為250 mg/kg左右，所以選擇濃度為0.3％的CuSO4作為比較芽孢桿菌菌株對(duì)Cu2+耐受的臨界濃度。得到3株可耐受高銅影響的菌株。 將經(jīng)過耐受性實(shí)驗(yàn)的3株菌分別進(jìn)行生物耗氧，抑菌試驗(yàn)，平板透明圈產(chǎn)酶分析法，篩選出2株具有潛在益生效果的菌株LBS53和LBS8。LBS53、LBS8分別與乳酸菌同皿培養(yǎng)，其乳酸菌的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于其它平皿的乳酸菌。說(shuō)明這兩株菌對(duì)腸道益生菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。LBS53對(duì)致病菌具有較強(qiáng)

9、抑菌特性，可以產(chǎn)蛋白酶，淀粉酶和纖維素酶，酶系較全。LBS8無(wú)明顯抑菌特性，但有較高的產(chǎn)蛋白酶能力。這兩株菌基本具備作為飼用芽孢桿菌制劑菌株的條件。尤其LBS53的優(yōu)良生物學(xué)特性使其在飼料工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。 二 菌種鑒定 對(duì)LBS53和LBS8進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和生理生化分析。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠2001)，初步判定LBS53為枯草芽孢桿菌，LBS8為蠟樣芽孢桿菌。 為了得到更加準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定

10、結(jié)果，本試驗(yàn)采用了分析細(xì)菌遺傳特征的保守序列16SrDNA的方法。利用酚氯仿抽提法提取芽孢桿菌的總DNA，Primer 5.0和oligo6軟件設(shè)計(jì)引物，然后用常規(guī)PCR法，對(duì)目的片斷進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR純化產(chǎn)物送與上海生物工程有限公司測(cè)序，所測(cè)序列輸入GenBank進(jìn)行同源比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明LBS53與枯草芽孢桿菌的同源性為99％，鑒定為枯草芽孢桿菌。LBS8與蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的同源性分別達(dá)到99％。為了準(zhǔn)確鑒定LBS8，進(jìn)

11、一步做了試驗(yàn)。LBS8為淀粉酶試驗(yàn)陰性和青霉素酶試驗(yàn)陽(yáng)性，蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素染色未發(fā)現(xiàn)染成黑色的菱形毒素結(jié)晶體。從而確定LBS8為蠟樣芽胞桿菌。 三 液體發(fā)酵條件的優(yōu)化 1)單因素條件的優(yōu)化。對(duì)9種碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、玉米淀粉、糖蜜、牛肉膏)進(jìn)行篩選，確定LBS53的最佳碳源為玉米粉，最適濃度為3％；LBS8的最佳碳源為糖蜜，最適濃度為3％。對(duì)5種氮源(大豆蛋白胨、動(dòng)物蛋白胨、酵母粉、黃豆粉

12、、干酪素)進(jìn)行篩選，確定LBS53最佳氮源為豆柏粉，最適濃度為4％；LBS8最佳氮源為豆柏粉，最適濃度為4％。碳氮比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LBS53的最佳碳氮比為2％:4％，LBS8的最佳碳氮比1％: 5％。 分析不同NaCl、鎂離子、錳離子濃度，不同K2HPO4:KH2PO4配比，對(duì)LBS53和LBS8菌量的影響，從而確定兩株菌的最適K2HPO4:KH2PO4配比均為0.1％：0.075％，最適NaCl濃度為0.6％，最適MgSO4·7

13、H2O濃度為0.025％，LBS53最適MnSO4濃度0.005 mmol/L，MnSO4濃度對(duì)LBS8影響不大。 2)正交實(shí)驗(yàn)分析。在單因素分析實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以菌量為指標(biāo)，對(duì)LBS53和LBS8液體發(fā)酵中提高菌體生物量的發(fā)酵工藝與條件進(jìn)行研究，通過正交試驗(yàn)和最適PH、最適溫度、溶氧度等條件分析，最終確定LBS53液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉2％，黃豆粉4％，K2HPO4:KH2PO4為0.1％：0.075％，MgSO4·7H2O

14、 0.025％，MnSO40.001 mmol/L，NaCl 0.6％。LBS8液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：糖蜜2％，黃豆粉5％，K2HPO4:KH2PO4為0.2％：0.075％，MgSO4·7H2O 0.025％，NaCl 0.6％。 (3)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度、pn值、接種量、轉(zhuǎn)速等進(jìn)行優(yōu)化后，得出最佳發(fā)酵條件為。LBS53；溫度40℃，pH7.5，搖瓶裝量30 mL/250 mL，接種量5％，搖床轉(zhuǎn)速180 r