泛素基因在煙草耐鹽性中的作用及其生理機(jī)制研究.pdf

1、在生物細(xì)胞生命周期中不斷有新的功能蛋白產(chǎn)生，與此同時(shí)也必然伴有結(jié)束其生命功能的蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)的降解與其合成過程一樣，對植物的生理代謝和生長發(fā)育起著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解受到精確的時(shí)間和空間調(diào)節(jié)，并具有高度選擇性。泛素/26S蛋白酶體途徑(ubiquitin/26S protcasome pathway，UPP)是目前已知最重要的、有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑。在這個(gè)途徑中，泛素用來標(biāo)記需要降解的蛋白質(zhì)，被標(biāo)記的靶蛋白進(jìn)而被

2、26S蛋白酶體識別并降解。逆境脅迫下生物細(xì)胞內(nèi)無功能蛋白質(zhì)的積累增多，及時(shí)清除這些無功能蛋白質(zhì)成為生物適應(yīng)逆境的重要方式。已有研究表明，泛素基因在逆境條件下表達(dá)顯著增加，短命調(diào)節(jié)蛋白及異常蛋白降解速率加快，間接說明泛素系統(tǒng)在生物逆境適應(yīng)中的作用。但過量表達(dá)泛素基因以及抑制泛素基因表達(dá)對植物逆境適應(yīng)性的影響及其生理機(jī)制研究還鮮見報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆了小麥單體泛素基因，構(gòu)建了正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草獲得了過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因株

3、系多個(gè)，研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)泛素提高了煙草的抗旱性、耐鹽性。同時(shí)克隆了煙草的泛素基因，構(gòu)建了反義表達(dá)載體，反義轉(zhuǎn)化煙草獲得了抑制煙草泛素基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。本論文以正義轉(zhuǎn)基因煙草及抑制泛素基因表達(dá)的反義轉(zhuǎn)基因煙草為材料，研究調(diào)控泛素系統(tǒng)對植物抗逆性的影響。從種子萌發(fā)、幼苗生長狀況、膜傷害程度、活性氧積累與清除、離子平衡及光合能力等方面分析了泛素系統(tǒng)影響植物抗逆性的生理生化機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)泛素單體增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性，抑制泛素基

4、因的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株抗鹽性減弱。主要結(jié)果如下： 1、泛素蛋白豐度檢測結(jié)果表明，過量表達(dá)泛素基因或抑制泛素基因表達(dá)對于轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞內(nèi)泛素單體蛋白豐度影響不大；過量表達(dá)泛素蛋白會使結(jié)合態(tài)泛素蛋白含量增加，鹽脅迫下這種增加更為明顯；抑制泛素基因表達(dá)會降低結(jié)合態(tài)泛素蛋白的積累。 2、正常生長條件下，過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因?qū)ΨN子的萌發(fā)和幼苗的生長就有促進(jìn)作用；抑制Nt-Ub1泛素基因?qū)ΨN子萌發(fā)和植株的生長有延緩作用。鹽脅

5、迫導(dǎo)致種子萌發(fā)延遲及幼苗生長抑制，過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因能促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長，緩解鹽脅迫導(dǎo)致的生長抑制，轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽性增強(qiáng)：抑制泛素基因表達(dá)使種子萌發(fā)推遲，加劇了鹽脅迫下的生長抑制。 3、鹽脅迫會破壞生物膜的穩(wěn)定性和完整性，導(dǎo)致活性氧積累及膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的增加，膜透性增強(qiáng)。過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株中主要抗氧化酶的活性增強(qiáng)，活性氧積累減少，MDA含量及電解質(zhì)外滲量較低，有效保護(hù)了生物膜的穩(wěn)定性和

6、完整性；抑制泛素基因表達(dá)導(dǎo)致鹽脅迫下生物膜的損傷更為嚴(yán)重。 4、鹽脅迫不僅會造成滲透脅迫，還會引起離子毒害。過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因能使轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下保持較好的水分狀況，并有效維持體內(nèi)的離子平衡，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性：抑制泛素基因加劇了鹽脅迫對于植物體造成的滲透脅迫和離子毒害作用，抗鹽性降低。 5、鹽脅迫會導(dǎo)致植物光合機(jī)構(gòu)受到損傷，表現(xiàn)為色素含量降低、PSII光化學(xué)效率下降。過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因

7、的轉(zhuǎn)基因植株碳同化速率、PSII光化學(xué)效率的下降及色素降解速率相對緩慢，鹽脅迫下能維持較高的光合作用效率；抑制泛素基因表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株光合能力降低。 6、對轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)活性氧積累進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)抑制泛素基因表達(dá)會加劇轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)活性氧的積累，而過量表達(dá)泛素基因的植株體內(nèi)積累活性氧較少。推測活性氧積累的不同可能是不同轉(zhuǎn)基因植株抗逆性差異的原因之一，泛素系統(tǒng)與活性氧清除有關(guān)。用外源甲基紫精處理，造成氧化脅迫，檢測了不同轉(zhuǎn)基因煙草耐

8、氧化脅迫的能力，證明過量表達(dá)泛素提高了煙草的耐氧化脅迫能力；而反義抑制泛素表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的耐氧化脅迫能力較野生型差，進(jìn)一步證明了泛素水平與耐氧化脅迫有關(guān)。 7、過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草對綜合脅迫(高鹽+高溫+高光強(qiáng))的抗性，并加速了植物的生長發(fā)育進(jìn)程，使轉(zhuǎn)基因植株花期提前。反義抑制泛素基因表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)早衰及灼傷斑點(diǎn)，抗逆性降低。 綜上所述，過量表達(dá)泛素單體提高了轉(zhuǎn)基因煙草對鹽脅迫甚至綜合脅迫