刺參有益菌制劑的研制與應用研究.pdf

1、目前，刺參養(yǎng)殖已成為中國北方最大的海水養(yǎng)殖種類，養(yǎng)殖面積達7萬公頃，遍布江蘇北部、山東、遼寧、河北等地，年產值約200億元。然而，頻繁發(fā)生的刺參病害問題給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失，嚴重制約了該產業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展?？股丶跋舅幬锏氖褂媚芤欢ǔ潭染徑饧膊〉陌l(fā)生，但由于其能在養(yǎng)殖動物體內殘留，并進而威脅人類健康，而且大量使用能導致耐藥菌株滋生，目前其使用已受到嚴格限制。刺參養(yǎng)殖量大，而且不具有特異性免疫，因此通過疫苗控制刺參病害也不

2、可行。益生菌由于能夠抑制病原微生物、調節(jié)動物腸道微生態(tài)環(huán)境、增強養(yǎng)殖動物免疫力，且綠色環(huán)保。因此，人們開始越來越多的關注益生菌在刺參養(yǎng)殖中的應用研究。本論文分4部分。 1.采用形態(tài)學、生理生化指標測定以及16S rDNA序列分析等方法，鑒定了3株病原拮抗菌。菌株TYIA-16、TYIA-25’、TYIA-26分別被鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)和屎腸球菌(

3、Enterococcusfaecium)。其中，屎腸球菌能耐低溫，在0℃的極端低溫下也可生長。 2.研究了菌株TYIA-12(Bacillus atrophaeus)、TYIA-15’(Bacillus subtilis)、TYIA-16(Bacillus subtilis)及TYIA-25’(Bacillus cereus)的生長特性，得到了試驗菌的最適生長條件以及最佳的發(fā)酵時間。由于刺參特殊的生活習性，冬春季是其發(fā)病高峰期，

4、因此進行了菌株的溫度試驗，結果表明試驗菌株耐高溫，但低于6℃不能生長，因此在極低溫度下需與其它低溫菌種混合使用。試驗菌株均能有效的降解海參餌料，并利用其大量增殖。菌株之間的拮抗試驗發(fā)現(xiàn)菌株TYIA-15’能強烈抑制其余3株菌的生長。 刺參營底棲生活，主要以底泥、硅藻、細菌、有機碎屑為食，施用的益生菌如何能有效到達池底并被刺參攝食是一個有待解決的問題。本試驗選擇沸石粉(粒徑<80目)作為芽孢桿菌孢子的載體，結果表明，沸石粉對試驗菌

5、的吸附率達95％以上。沸石粉投入水體后迅速下沉，95％以上的沸石粉可沉入底部，且對刺參安全無害，因此可作為有益菌的有效載體應用于刺參養(yǎng)殖。試驗并以沸石粉為載體，制備了芽孢桿菌的活性制劑(活菌量>1.5×109cfu/g)，結果表明，芽孢桿菌活性制劑能長時間保持活性，存放半年后的存活率均在70％以上。 3.將基礎餌料為對照，分別在餌料中添加1％的單一芽孢桿菌制劑(TYIA-1)和復合芽孢桿菌制劑(TYIA-12:TYIA-16:T

6、YIA-25'=1:1：1)投喂刺參(制劑中活菌量為1.5×109cfu/g)，以研究芽孢桿菌制劑對刺參生長、免疫以及腸道菌群的影響。結果顯示，芽孢桿菌制劑能顯著提高刺參的特定生長率(SGR)及腸道蛋白酶活性(P<0.05)，但降低了刺參腸道淀粉酶活力。體腔液中免疫指標的測定發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌制劑能顯著提高體腔液中堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性(P<0.05)，對超氧化物歧化酶(SOD)活性無顯著影響。試驗組刺參攻毒后的累計死

7、亡率均低于對照組，其中，投喂復合菌劑組與對照組差異顯著(P<0.05)。試驗還表明，芽孢桿菌制劑對刺參腸道菌群具有一定的調節(jié)作用。試驗還研究了單一芽孢桿菌制劑對刺參養(yǎng)殖水質的影響。結果顯示，試驗組的溶解氧(DO)略有降低，但對pH值無影響：菌株TYIA-15’和TYIA-16能一定程度抑制氨氮濃度的增加：試驗組芽孢桿菌數(shù)量先逐漸上升，12～15天達到高峰后開始下降，對照組沒有檢測到芽孢桿菌。 4.從感染“腐皮綜合征”的刺參病灶處

8、分離得到1株優(yōu)勢細菌HP1，經回接感染試驗證實其為刺參病原菌，采用形態(tài)學、生理生化指標測定以及16S rDNA序列分析等方法將其鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。蠟樣芽孢桿菌通常作為益生菌應用于畜禽及水產養(yǎng)殖中，本試驗發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌HP1菌株能引起刺參“腐皮綜合征”，建議在水產養(yǎng)殖中要謹慎使用，以避免損失。 本論文以從健康刺參腸道中分離得到的有益菌作為研究對象，制備了有益菌的活性制劑，并驗證了其在刺參養(yǎng)殖中

9、的益生作用。刺參營底棲生活，以底泥、硅藻、細菌、有機碎屑等為食，且養(yǎng)殖過程中基本不投餌。因此，施用的有益菌如何有效的到達池底，減少在水中的損失是使用的關鍵技術。本研究表明沸石粉能夠作為有益菌的有效載體，為益生菌在刺參養(yǎng)殖中的使用提供了途徑和方法。試驗驗證了芽孢桿菌制劑對刺參養(yǎng)殖的有益作用，表明其能緩解刺參疾病的發(fā)生，為研究刺參的病害防治工作提供了理論依據(jù)和實踐基礎。 目前，水產養(yǎng)殖中使用的益生菌多為外來菌種，大量使用將有可能導致