蠟狀芽胞桿菌對芘的生物降解及其降解基因的克隆與表達(dá).pdf

1、本論文以蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）為實(shí)驗(yàn)菌株，對水體中芘的微生物修復(fù)進(jìn)行了研究，考察其對芘的降解性能，分析其代謝產(chǎn)物和相關(guān)功能基因及功能酶，以期從分子生物學(xué)角度闡明芘在菌體內(nèi)的降解機(jī)理。
　　B. cereus降解芘的最優(yōu)無機(jī)鹽培養(yǎng)基濃度為：K2HPO4100 mg·L-1，KH2PO4100 mg·L-1，MgSO4·7H2O20 mg·L-1和檸檬酸鈉100 mg·L-1。在降解體系中加入1 mg·L-1

2、Mn2+、0.1 mg·L-1 Fe3+和10 mg·L-1葡萄糖混合物對芘的降解有明顯促進(jìn)作用；1 g·L-1菌體在120 h內(nèi)對2.5μmol·L-1芘的降解率達(dá)到61.4％。
　　利用LC-MS/MS分析芘代謝產(chǎn)物，檢測到1-萘酚、2-萘酚、9-羥基菲和1-羥基芘4種單羥基多環(huán)芳烴，表明芘在單加氧酶作用下開環(huán)降解，且B. cereus能有效分解利用4種代謝產(chǎn)物，其最高利用率分別為100%，90.3%，98.3%和52.7%。

3、酶活力分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B. cereus具有的水楊酸羥化酶，鄰苯二酚1,2-雙加氧酶和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶在芘的降解中起關(guān)鍵作用，其酶活力經(jīng)芘誘導(dǎo)后均有明顯提高。結(jié)合產(chǎn)物分析及酶活測定推斷B. cereus對芘的降解途徑以及降解過程是由單加氧酶和雙加氧酶聯(lián)合起作用。
　　通過設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，從B. cereus的質(zhì)粒中克隆出鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（C23O）基因，對其進(jìn)行序列測定和分析。該基因全長924 bp

4、，具有一個(gè)完整開放閱讀框的序列，編碼307個(gè)氨基酸氨基酸組成的C23O。理論蛋白分子量為35.16 kDa，等電點(diǎn)為5.46。編碼區(qū)G+C含量為61.8%，A+T含量為38.2%。將該C23O基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄的其它菌株的C23O基因序列進(jìn)行比對，分析相關(guān)菌屬親緣進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示B. cereus的C23O基因與假單胞菌屬（Pseudomonas）菌株C23O基因的相似性最高。
　　利用pET32a(+)質(zhì)粒對C2