油茶ACCase基因BC和β-CT亞基的全長cDNA克隆.pdf

1、油茶是我國南方重要的木本油料之一,所產(chǎn)種子用以榨油,茶油富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸脂肪,含量一般在90％以上,食用茶油有益于人們健康。乙酰輔酶A羧化酶是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶和限速酶,因此研究油茶的乙酰輔酶A羧化酶基因?qū)τ诮沂居筒栌椭铣梢?guī)律和油茶的分子育種具有重大意義。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶BC基因的全長cDNA克隆。以優(yōu)良無性系‘湘林1號’種子為材料提取RNA,將其反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板,根據(jù)其它物種

2、中BC基因保守區(qū)域的核苷酸序列,用專業(yè)軟件Primer Premier5.0設(shè)計簡并引物,通過簡并PCR擴(kuò)增出BC基因的部分片段,克隆產(chǎn)物經(jīng)過插入pMD18-T載體,以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株等一系列操作之后送至生物公司測序,根據(jù)簡并段的cDNA測序結(jié)果,設(shè)計RACE特異引物,運用RACE技術(shù)擴(kuò)增出兩個亞基BC的完整5’端和3’端,這些克隆片斷通過VectorNTI9.0等生物信息學(xué)軟件的分析,相互之間有序的拼接,獲得了長度為1901

3、bp的序列。根據(jù)拼接得到的序列,為BC設(shè)計了三對交錯引物,其產(chǎn)物分別對應(yīng)為A1、A2和A3,BC的三條交錯片段A1和A2重疊19bp,A2和A3重疊16bp,最后用A1的上游引物BC JCF1和A3的下游引物BC JCR3擴(kuò)增出BC的完整CDS,回收克隆片斷、克隆、轉(zhuǎn)化及測序,由此得到的測序結(jié)果與拼接的BC的全長cDNA序列完全一致,從而獲得了油茶BC基因的全長cDNA。
　　 2.油茶β-CT基因的全長cDNA克隆。克隆β-C

4、T基因所采用的技術(shù)手段與BC的一樣,β-CT基因的簡并PCR產(chǎn)物、5'RACE產(chǎn)物以及3’RACE產(chǎn)物分別為725bp、691bp和1375bp,β-CT基因的全長cDNA的長度為1987bp。兩個RACE產(chǎn)物之間有重疊區(qū)域,設(shè)計兩對交錯引物,其產(chǎn)物分別為B1、B2,兩者之間有23bp的重疊區(qū),交錯延伸得到所得到的β-CT基因的完整CDS,經(jīng)過克隆、轉(zhuǎn)化及測序確定其為β-CT基因。
　　 3.油茶BC基因的生物信息學(xué)分析。通過生

5、物信息學(xué)軟件Vector NTI9.0對測序結(jié)果進(jìn)行分析:BC基因cDNA序列長1901bp,含有一個1599bp的ORF,編碼533個氨基酸殘基；此外還含有長81bp的5端非編碼區(qū),長218bp的3端非編碼區(qū)及一個polyA尾巴；經(jīng)過在GenBank上的序列比對獲知此序列與其它物種的BC基因的同源性達(dá)到87％以上,由此確認(rèn)此序列是油茶的BC基因的全長cDNA序列。根據(jù)BC基因的cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列,應(yīng)用一系列生物信息學(xué)軟件對理

6、化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)、三維模型等進(jìn)行預(yù)測分析,結(jié)果顯示該蛋白的等電點pI為6.88,分子量為58509.3Da,兩個跨膜結(jié)構(gòu)域,沒有信號肽剪接位點,是一個非分泌蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為40.81,是不穩(wěn)定蛋白；BC蛋白內(nèi)含有31.33％的α-螺旋,18％的B折疊。模體搜索結(jié)果表明在BC上具有N-糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、ATP結(jié)合位點等多個功能結(jié)構(gòu)域。同源建模的模型中我們可以發(fā)現(xiàn)12個明顯α-螺旋,整個BC蛋白為一個內(nèi)凹的結(jié)構(gòu),這可能與B

7、C能結(jié)合生物素的功能相關(guān)。
　　 4.油茶β-CT基因的生物信息學(xué)分析。β-CT基因cDNA序列長1987bp,含有一個1530bp的ORF,編碼510個氨基酸殘基；含有長454bp的3端非編碼區(qū)及polvA尾巴；GenBank上的序列BLAST比對獲知此序列與其它物種的β-CT基因的同源性達(dá)到87％,因此可確定此序列是油茶的β-CT基因的全長cDNA序列。對β-CT基因cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示β

8、-CT蛋白的等電點pI為5.17,分子量為58077.9Da,兩個跨膜結(jié)構(gòu)域,沒有信號肽剪接位點,是一個非分泌蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為43.28,是不穩(wěn)定蛋白；該蛋白內(nèi)含有27.99％的α-螺旋,17.85％的β-折疊。模體搜索結(jié)果表明在β-CT上具有多種N-糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、N-肉豆蔻磷酸化位點等多個功能結(jié)構(gòu)域。同源建模時發(fā)現(xiàn)β-CT前面277個氨基酸的結(jié)構(gòu)沒找到合適的模板,部分序列的模型中我們發(fā)現(xiàn)了7個明顯α-螺旋和5個β