表達傳染性法氏囊病毒VP2蛋白重組馬立克病毒CV1988-Rispens轉移載體構建.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病。我國目前廣泛采用中等毒力活疫苗防治IBD，但每年由IBD造成的經(jīng)濟損失巨大，超強毒株的出現(xiàn)更是對中國養(yǎng)禽業(yè)防治IBD構成了巨大威脅。使用毒力強的活疫苗，造成了更嚴重的法氏囊病理損傷和免疫抑制。如此長期大量的使用毒力不斷增

2、強的活疫苗，被認為是變異株和超強毒株出現(xiàn)的一個重要原因。
　　 長期以來國內(nèi)外學者一直都在嘗試利用分子生物學和生物技術的方法研制IBD新型疫苗，近年來這些嘗試和努力已經(jīng)取得了可喜的研究進展。馬立克病毒CVI988/Rispens疫苗株作為病毒活載體的安全性和有效性已經(jīng)得到證實。本研究以CVI988/Rispens疫苗株為載體，在其基因組的復制完全非必需區(qū)US2插入IBDV-VP2抗原保護性基因，并在CMV啟動子的控制下得以穩(wěn)定表

3、達，通過間接免疫熒光試驗初步證實獲得了無報告基因的表達IBDV-VP2蛋白重組馬立克病毒CVI988/Rispens。
　　 1馬立克病毒CVI988/Rispens疫苗株通用轉移載體pUC-VP2-US2的構建
　　 通過PCR方法擴增出馬立克病毒(CVI988/Respense株)基因組復制完全非必需片段US2區(qū)的左翼和右翼，分別命名為US2L和US2R。將US2L和US2R先后克隆入pUC18載體，陽性克隆命名為p

4、UC-US2。然后將完整的法氏囊病毒VP2基因表達盒(包括CMV啟動子，VP2 ORF以及PolyA信號)，以限制性內(nèi)切酶XholⅠ和BglⅡ克隆入pUC-US2，獲得不含任何報告基因的重組質粒pUC-VP2-US2。在脂質體介導下將該重組質粒轉染雞胚成纖維細胞(CEFs)。間接免疫熒光實驗結果表明，該重組質?？梢栽贑EFs中表達法氏囊病毒VP2蛋白。這為下一步將該重組質粒轉染感染馬立克病毒的CEFs，獲得表達法氏囊病毒VP2蛋白的重組

5、馬立克病毒奠定了基礎。
　　 2重組轉移載體pUC-VP2-US2的瞬時表達及rMDV的初步檢測
　　 采用傳統(tǒng)細胞計數(shù)法繪制了CEF的生長曲線，確定了轉染CEF細胞的最佳時間。采用脂質體轉染方法對轉染時機、脂質體與質粒的體積質量比以及轉染的細胞密度等進行了摸索。確定了重組轉移載體最佳轉染條件為在24孔細胞培養(yǎng)板上均勻鋪滿2×105細胞/孔，24小時后用Lipofectamine2000 reagent1.5μl和pUC

6、-VP2-US2質粒1.0μg進行轉染。最佳轉染條件的確定增加了重組轉移載體與馬立克病毒發(fā)生細胞內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組馬立克病毒的可能性。在此轉染條件下對感染馬立克病毒CVI988的CEF細胞轉染重組質粒pUC-VP2-US2，通過細胞內(nèi)同源重組。轉然后4天將病毒空斑消化后，均勻感染兩塊96孔板。4天后通過用IBDV-VP2單克隆抗體185做間接免疫熒光實驗，初步檢測到了表達IBDV-VP2蛋白的重組馬立克病毒陽性空斑，證明轉移表達質粒構建