玉米大斑病菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ras基因的克隆與功能研究.pdf

1、由玉蜀黍凸臍蠕孢真菌引起的玉米大斑病是當(dāng)今玉米生產(chǎn)上的重要病害之一，經(jīng)常會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前的試驗(yàn)研究表明，許多植物病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、蛋白的輸出和分泌都受到細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，如Ras、MAPK、cAMP及Ca2+途徑等，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)植物病原真菌生長(zhǎng)發(fā)育以及致病性均有重要的調(diào)節(jié)作用。其中，Ras蛋白位于MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游，ras基因在進(jìn)化中高度保守，廣泛存在于各種真核生物中，如：哺乳動(dòng)物類(lèi)、真菌、線蟲(chóng)及酵母

2、中。遺傳學(xué)、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的試驗(yàn)研究表明，Ras在細(xì)胞外刺激所產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于中樞地位。因此，深入研究Ras蛋白的功能有利于研究病菌的發(fā)育和侵入機(jī)制等，同時(shí)對(duì)研究病菌與寄主植物之間的互作以及有關(guān)植物病害防治、方法具有重要的理論意義。本試驗(yàn)對(duì)玉米大斑病菌的Ras蛋白進(jìn)行了初步研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)已知的植物病原真菌ras基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得玉米大斑病菌ras基因的同源片

3、段，利用Genome walking技術(shù)獲得了ras基因的DNA全長(zhǎng)序列。利用BLASTX軟件對(duì)該基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該序列與Pyrenophora tritici、Phaeosphaeria nodorum SN15、Magnaporthe grisea的ras基因同源性為80％～90％。
　　 2.利用ras基因特異性抑制劑—手霉素A處理玉米大斑病菌，對(duì)Ras蛋白的功能進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，經(jīng)手霉素A處理后，

4、病菌可以形成與野生型同樣正常的菌絲和分生孢子，但分生孢子萌發(fā)的時(shí)間發(fā)生延遲、且芽管短小、粗大；分生孢子萌發(fā)率和附著胞產(chǎn)生數(shù)量明顯下降。用20～120 μmol/L濃度的手霉素A處理6～36 h后，在此處理區(qū)間范圍內(nèi)，手霉素A對(duì)分生孢子萌發(fā)和附著胞產(chǎn)生的抑制程度隨著濃度增加而上升，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。
　　 3.進(jìn)一步利用DNAMAN軟件分析了ras基因片段的酶切位點(diǎn)，并且基于pSO-Ⅰ質(zhì)粒構(gòu)建了玉米大斑病菌ras基因的反