凡納濱對(duì)蝦溶菌酶基因在大腸桿菌和酵母中的重組表達(dá)和活性檢測(cè).pdf

1、凡納濱對(duì)蝦溶菌酶（Litopenaeus vannamei lysozyme，LvLys）是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要的效應(yīng)因子，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，在溶菌過(guò)程中形成了一個(gè)水解體系，破壞和消除侵入體內(nèi)的病原，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體的免疫防御，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的作用以及止血、消腫、防腐和加快組織修復(fù)等功能。溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是一種天然的抗菌劑，能特異性地作用于N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，N

2、AG）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，使微生物細(xì)胞在內(nèi)部滲透壓的作用下漲裂，細(xì)胞質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。溶菌酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌有很好的抑菌作用，對(duì)人和動(dòng)物的細(xì)胞則不發(fā)生溶菌作用，被WHO和許多國(guó)家認(rèn)定為無(wú)毒、無(wú)害、安全的添加劑，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、生物技術(shù)、食品以及動(dòng)物生產(chǎn)中。水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶按其來(lái)源分為三類(lèi)：c型溶菌酶、g型溶菌酶和i型溶

3、菌酶，凡納濱對(duì)蝦溶菌酶屬于c型溶菌酶。通常凡納濱對(duì)蝦溶菌酶是從凡納濱對(duì)蝦血液中少量提取獲得，由于來(lái)源困難，不能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，而采取DNA重組技術(shù)，從原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶是解決其供需矛盾的有效途徑。 本研究通過(guò)采集凡納濱對(duì)蝦血淋巴，從血細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增凡納濱對(duì)蝦溶菌酶基因（稱(chēng)為L(zhǎng)vLys基因）的開(kāi)放閱讀框cDNA序列，將其克隆至pMD18-T載體中，經(jīng)過(guò)篩選鑒定后，將重組質(zhì)粒pMD18-

4、T/LvLys進(jìn)行序列測(cè)定。然后將測(cè)序正確的基因序列用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切后的目的基因與通過(guò)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-28a（+）連接，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28（a+）/LvLys，并將其轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和親和純化，得到了純化的重組溶菌酶，并進(jìn)行了抑菌活性檢測(cè)。同時(shí)，在溶菌酶原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)帶有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物擴(kuò)增出凡納濱對(duì)蝦

5、溶菌酶基因的全基因片段，然后將目的基因片段克隆至巴氏畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC6a中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC6aA/LvLys，經(jīng)過(guò)BamHⅠ和SacⅠ雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pAO815質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAO815-pPIC6aA/LvLys，重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ線性化后，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化至巴氏畢赤酵母GS115細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)G418篩選和PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性克隆經(jīng)甲醇誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。 結(jié)果表明，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)