辣椒抗CMV基因同源序列克隆與分子標(biāo)記研究.pdf

1、辣椒是我國大面積種植的蔬菜之一，深受人民的喜愛。黃瓜花葉病毒(CMV)是危害我國辣椒生產(chǎn)的主要病毒，嚴(yán)重影響了辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此抗CMV已成為辣椒抗病育種的主要目標(biāo)，并且已經(jīng)尋找到部分優(yōu)良抗源。但在抗性轉(zhuǎn)育過程中傳統(tǒng)遺傳育種方法繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故通過尋找抗性基因或與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，將會大大提高辣椒抗CMV育種效率。迄今為止，仍未見成功克隆辣椒抗CMV基因的報(bào)道。本研究以高抗黃瓜花葉病毒材料(Yv2007001)和高感黃瓜

2、花葉病毒材料（Yv2007002）為試材，應(yīng)用同源序列候選基因法和mRNA差異顯示技術(shù)進(jìn)行了抗病基因序列的篩選。同時(shí)以Yv2007001、Yv2007002及其Fi、F2為試材，篩選與抗病基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記。并對接種CMV后，辣椒部分防御酶活性進(jìn)行測定，為選育抗黃瓜花葉病毒辣椒品種提供生理指標(biāo)。具體結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)已知抗病基因的NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物，以高抗CMV辣椒Yv2007001為試材，獲得10條抗

3、病基因同源序列(RGAs)。經(jīng)序列分析，這些RGAs皆具有開放閱讀框和NBS保守結(jié)構(gòu)域(P-loop、 Kinase-2、 Kinase-3a、 RNBS-C和GLPL)，屬于nonTIR-NBS-LRR類抗病基因同源序列。其中RGA46與番茄花葉病毒抗性基因Tm-22的氨基酸同源性為78％，可能與辣椒抗CMV相關(guān)。其它序列與已知抗病基因Prf、 RPP13、12C-1、Mi-1.2、L6、M氨基酸相似性為21％-70％。所得RGAs序

4、列的Ka/Ks值介于0.011-0.3051，均顯著小于1，表明“純化選擇”在辣椒NBS區(qū)域進(jìn)化中起主要作用。
　　 2.采用mRNA差異顯示技術(shù)研究了抗、感CMV辣椒在接種CMV前后基因表達(dá)的差異，共分離到87個(gè)差異片段，經(jīng)回收、重?cái)U(kuò)增和克隆，進(jìn)一步測序、數(shù)據(jù)庫比對，獲得7個(gè)辣椒cDNA片段。結(jié)果表明：抗、感辣椒材料在接種CMV后產(chǎn)生多種表達(dá)序列，具有誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)，抗病材料(Yv2007001)的差異條帶數(shù)目比感病材料(Yv

5、2007002)的差異條帶少。經(jīng)序列同源性分析，這些cDNA片段在Genbank中與已有番茄、辣椒、水稻、葡萄的部分序列具有同源性，但同源性不高，可能為辣椒特有的cDNA序列。由于差別顯示技術(shù)存在假陽性高的缺陷，這些片斷的可靠性還有待于通過反式Northern雜交或?qū)崟r(shí)PCR技術(shù)驗(yàn)證，其結(jié)構(gòu)和功能也有待于進(jìn)一步深入研究。
　　 3.利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，以極端抗病和極端感病辣椒單株的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物（各8株）構(gòu)建抗感基因池，分別以

6、8個(gè)EcoRI引物，8個(gè)MseI引物和8個(gè)PstI引物組合成128對引物組合，篩選辣椒與抗CMV基因連鎖的AFLP分子標(biāo)記。結(jié)果顯示：128對引物組合中4對引物組合(E39/M41、E22/M20、P5/M13、E18/M06)在抗、感池之間存在差異條帶。這4個(gè)引物組合經(jīng)F2代單株驗(yàn)證和連鎖分析，表明引物E18/M06篩選出的特異帶穩(wěn)定存在，連鎖距離為25.4cM，該特異性片段約為450bp，命名為E18/M06450。
　　

7、4.通過測定接種后不同時(shí)期辣椒葉片SOD、POD、CAT活性、可溶性蛋白含量及葉綠素含量的變化規(guī)律，結(jié)果表明：辣椒苗期磷酸對照葉片3種防御酶活性變化均處在一定范圍內(nèi)，且變化幅度不大，抗病材料波動(dòng)幅度小于感病材料。接種CMV后，SOD、POD活性抗病材料高于感病材料，呈先升后降趨勢，抗性不同，上升幅度和達(dá)到峰值的時(shí)間不同。抗病材料CAT活性呈先降后升再降趨勢，感病材料CAT活性變化呈雙峰趨勢，發(fā)病后期酶活性高于抗病材料.可溶性蛋白含量至癥