紫花苜蓿根際氫氧化細(xì)菌的分離鑒定及促生機(jī)制研究.pdf

1、為進(jìn)一步篩選對(duì)植物生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用的氫氧化細(xì)菌，逐步開發(fā)微生物肥料以促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究以陜西地區(qū)不含吸氫酶的結(jié)瘤豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa)根際為研究材料，逐步完善氫氧化細(xì)菌的分離、培養(yǎng)技術(shù)；深入了解其生理生化特性，并進(jìn)行鑒定，豐富現(xiàn)有的基于氫氧化細(xì)菌的種屬分類地位的研究；探索其促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用機(jī)制，主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 利用持續(xù)通H2的氣體循環(huán)培養(yǎng)體系，以電解水的方式產(chǎn)生H2，與通入的空氣

2、混合，形成流速為280 mL/min，含H2量為4.16×10-4-2.42×10-3 mol/L的混合氣體，富集土壤中的氫氧化細(xì)菌，富集的土壤樣品經(jīng)礦質(zhì)鹽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，共分離純化出37株細(xì)菌。 氣相色譜測(cè)定菌株的氧化H2能力，結(jié)果顯示有8株菌的吸氫值大于2.44×10-4 mol/L，占測(cè)定菌株總數(shù)的25.93％，初步確定為氫氧化細(xì)菌。其中菌株WMQ-7和FMG-5的吸氫值大于12.28×10-4mol/L，而菌株WMQ-7

3、的氧化氫能力最強(qiáng)，達(dá)19.90×10-4mol/L。 通過對(duì)8株氫氧化細(xì)菌的形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，初步鑒定其分屬于鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、脂肪桿菌屬(Pimelobacte)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、勒米諾氏菌屬(Leminorella)、地桿菌屬(Terrabacter)和稀有桿菌屬(Rarobacter)。同時(shí)檢測(cè)了菌株WMQ-7的最適培養(yǎng)條件：最適碳源葡

4、萄糖、最適溫度30℃、最適pH7.0。 對(duì)8株氫氧化細(xì)菌進(jìn)行了小麥促生實(shí)驗(yàn)，平板檢測(cè)結(jié)果顯示：菌株WMQ-7、FMG-3、FMG-5對(duì)小麥的促生作用表現(xiàn)極為顯著，根長(zhǎng)與空白對(duì)照相比分別增加了73.92％、74.78％、58.26％；苗長(zhǎng)比空白對(duì)照增加34.64％以上，其中菌株FMG-3處理的小麥苗增加了67.64％；小麥種子的根上部分干重平均值比空白對(duì)照分別增加95.24％、57.14％、47.62％。菌株FMG-5、WMQ-7

5、、FMG-3處理的盆栽小麥在成熟后小麥麥粒數(shù)分別比對(duì)照多1倍以上。菌株WMQ-7、FMG-5、FMG-3處理的小麥，結(jié)穗收獲后制粉，面粉中的還原糖、總糖含量、蛋白質(zhì)含量都比對(duì)照有不同程度的提高，其中菌株FMG-3處理的小麥還原糖含量比對(duì)照提高了23.76％，總糖含量比對(duì)照提高7.38％。而菌株FMG-5對(duì)小麥蛋白質(zhì)含量的影響最為顯著，蛋白質(zhì)含量比對(duì)照提高了22.86％。 從ACC脫氨酶和鐵載體兩個(gè)方面探索氫氧化細(xì)菌促進(jìn)小麥生長(zhǎng)的

6、作用機(jī)制。利用薄層層析法篩選出一株ACC脫氨酶陽性菌株WMQ-7，茚三酮比色法檢測(cè)該菌株ACC脫氨酶活力為0.671 U/μg。 利用MSA—CAS和MKB—CAS檢測(cè)平板，通過培養(yǎng)基顏色的變化篩選產(chǎn)鐵載體的陽性菌株。菌株WMQ-7在MSA—CAS檢測(cè)平板上，菌落周圍藍(lán)色培養(yǎng)基變成粉色，而在MKB—CAS檢測(cè)平板上，菌落周圍藍(lán)色培養(yǎng)基變成黃色，說明該菌株能夠分泌產(chǎn)生鐵載體。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)鐵載體，結(jié)果顯示菌株WMQ-7分泌

7、的鐵載體在404 nm處有明顯的吸收峰，吸光值為0.834。與標(biāo)準(zhǔn)品2，3—DHBA的波長(zhǎng)掃描圖對(duì)照顯示，菌株WMQ-7分泌的鐵載體類型不是兒茶酚型。通過鄰菲噦啉檢測(cè)法，間接推算出菌株WMQ-7分泌產(chǎn)生的鐵載體的量為7.1996μg/mL。 對(duì)菌株WMQ-7、FMG-3、FMG-5的16S rDNA序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，氫氧化細(xì)菌在親緣關(guān)系上存在較大差異，遺傳距離較遠(yuǎn)。其中，菌株WIVIQ-7的16S rDNA

8、序列長(zhǎng)度為1451 bp，GC含量為，53.8％，與惡臭假單胞菌的同源性為99％，結(jié)合菌體形態(tài)和生理生化特性，進(jìn)一步鑒定菌株WMQ-7為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(GenBank登錄號(hào)為EU1807744)。菌株FMG-3、FMG-5的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1034 bp、1394 bp；GC含量分別為51.7％、54.45％。菌株FMG-5與根瘤菌相似性在94％，而菌株FMG-3的16S rDNA序列在