池蝶蚌親環(huán)蛋白的分子特征和功能研究.pdf

1、池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）產(chǎn)于日本滋賀縣的琵琶湖，比其它淡水珍珠蚌具有更好的抗病能力。本研究以淡水貝池蝶蚌為實驗對象采用RACE PCR方法獲得了其親環(huán)素蛋白家族（Cyps）中CyPD、CyPC和CyPH的cDNA基因全長：池蝶蚌CyPD基因cDNA（Gen Bank注冊號：KJ747387。）全長為2671bp，5’-非翻譯區(qū)（Untranslated Region,UTR)80bp，其中3’-UTR1487b

2、p包括一個多聚腺苷信號AAATAA和Poly(A)尾巴，1104bp的開放性閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼367個氨基酸，分子量約為41.09kDa，理論等電點pI=5.43；池蝶蚌CyPC基因cDNA全長為2050bp，5’-UTR89bp，其中3’-UTR500bp包括一個多聚腺苷信號AAAATAA和Poly(A)尾巴，1461bp的ORF編碼486個氨基酸，分子量約為55.93kDa，理論等電點pI=6

3、.07；池蝶蚌CyPH基因cDNA（Gen Bank注冊號為KJ747386。）全長為761bp，5’-UTR70bp，其中3’-UTR151bp包括一個多聚腺苷信號AAAATAA和Poly(A)尾巴，ORF540bp編碼179個氨基酸，分子量約為19.66kDa，理論等電點pI=7.60。生物信息學分析表明，CyPD、CyPC和CyPH具有典型的親環(huán)素肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶蛋白功能域，同時構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明在進化地位上也相當保守。

4、r>　　用CyPB基因完整的ORF與pET-32a構(gòu)建pET-32a-CyPB重組表達載體，將重組質(zhì)粒導入表達菌BL21（DE3）中進行原核表達，發(fā)現(xiàn)IPTG成功誘導了分子量約為40kDa的HsCyPB蛋白；結(jié)果還顯示蛋白主要存在于上清中，因而利用鎳離子親和層析法純化上清獲得單一的融合蛋白。
　　純化的HsCyPB作為抗原免疫日本大白兔制備的多克隆抗體，抗體的效價高達1:512000，說明獲得效價很高的抗體，而且Western b

5、lot檢測結(jié)果表明制備的多克隆抗體具有很好的特異性；利用HsCyPB的抗體對池蝶蚌肝臟冰凍切片進行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)HsCyPB蛋白在細胞質(zhì)和細胞膜上都有表達。
　　熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)CyPA、CyPB在池蝶蚌的八個組織中均有表達，并且在肝臟中表達量最高，其次是在腸和性腺，血中的表達量最低；根據(jù)池蝶蚌CyPA、CyPB基因的cDNA全長序列，構(gòu)建含有完整開放閱讀框(ORF)的pEGFP-C1-CyPA、pEGFP-C1-CyP

6、B表達載體；在轉(zhuǎn)染實驗過程中，人肝癌細胞（HePG2）作為實驗細胞，pEGFP-C1質(zhì)粒作為對照組A，pEGFP-C1-CyPA作為實驗組B，pEGFP-C1-CyPB作為實驗組C，pEGFP-C1-CyPA＋pEGFP-C1-CyPB作為實驗組D，利用轉(zhuǎn)染試劑將對照組和實驗組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人肝癌細胞（HePG2）中進行真核表達，細胞在培養(yǎng)36h后在共聚焦顯微鏡中發(fā)現(xiàn)實驗組的熒光明顯比對照組多，同時在流式細胞儀檢測中發(fā)現(xiàn)實驗組額熒光比對