醋酸甲孕酮單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、醋酸甲孕酮（Medroxyprogesterone Acetate，MPA）是一種人工合成的激素，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，曾被用作動(dòng)物生長促進(jìn)劑。由于醋酸甲孕酮有致乳腺癌的作用，我國和歐盟已禁止在動(dòng)物性食品生產(chǎn)中使用該藥物。國內(nèi)外已建立了很多理化方法檢測動(dòng)物性食品中殘留的醋酸甲孕酮。雖然有些方法比較靈敏精確，但由于花費(fèi)大、時(shí)間長、技術(shù)要求高等原因而不適合大批量樣品的篩選。作為一種快速、靈敏、特異的方法，酶聯(lián)免疫吸附測定正逐漸應(yīng)用于藥物的殘留檢測

2、。本研究通過抗原的合成和抗體的制備，建立了MPA的ELISA測定方法。
　　 本文采用O-（羧甲基）羥胺法合成醋酸甲孕酮-3-（O-羧甲基）肟（MPS）半抗原。用二環(huán)己基碳化二亞胺偶聯(lián)法分別將醋酸甲孕酮-3-（O-羧甲基）肟與牛血清白蛋（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)合成人工完全免疫原和包被抗原。用紫外掃描和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對人工抗原進(jìn)行初步鑒定，確定偶聯(lián)成功。分光光度法估算MPS-BSA、MPS-OVA中半抗原與

3、載體蛋白的偶聯(lián)比率，最后測MPS-BSA的偶聯(lián)比為19：1；MPS-OVA偶聯(lián)比為18：1。
　　 用人工合成的醋酸甲孕酮．牛血清白蛋白（MPA-BSA）作為抗原免疫BALB/C小鼠4次后，間接ELISA測定免疫小鼠體內(nèi)的MPA抗體效價(jià)，取1只免疫效果最佳小鼠的脾細(xì)胞，在PEG作用下與SP2/0細(xì)胞融合，利用雜交瘤技術(shù)篩選得到2株穩(wěn)定分泌醋酸甲孕酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4C11A386和4C11G8H6。對這兩株細(xì)胞的上清和腹

4、水進(jìn)行效價(jià)測定，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1：640和1：320，腹水效價(jià)分別為1：2.56×106和1：1.6×106。對兩株單抗進(jìn)行鑒定：雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)分別為99.64±1.5和99.35±1.5，其分泌的抗體亞型均為IgG2a。將兩株細(xì)胞經(jīng)體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，其抗體分泌穩(wěn)定。
　　 利用4C11A386雜交瘤細(xì)胞株的腹水單抗建立檢測醋酸甲孕酮?dú)埩舻拈g接競爭ELISA方法。繪制出醋酸甲孕酮間接競爭ELISA檢測方法的

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-30.022LogC+90.191，R2=0.9911，此方法可測定的最適范圍為1～100ng/mL；ciELISA檢測顯示其IC50為22ng/mL。在可測定范圍內(nèi)，孔雀石綠、無色孔雀石綠、己烯雌酚、四環(huán)素、恩諾沙星、呋喃唑酮、呋喃西林、氯霉素、青霉素等可能會因?yàn)橥瑫r(shí)使用而導(dǎo)致共同殘留的藥物未顯示交叉反應(yīng)性，表明該單抗具有較好的敏感性和特異性。
　　 本研究通過將MPA轉(zhuǎn)化為人工抗原，免疫小鼠，成功地制備出了醋